東農(nóng)冬麥1號(hào)越冬期間的microRNA高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析.pdf

1、東農(nóng)冬麥1號(hào)作為黑龍江省唯一能安全過(guò)冬的栽培品種，有著重要抗寒miRNA和miRNA相關(guān)靶基因資源。
　　 本研究旨在挖掘東農(nóng)冬麥1號(hào)的優(yōu)良抗寒miRNA資源。一方面揭示“東農(nóng)冬麥1號(hào)”強(qiáng)抗寒機(jī)理，拓寬冬小麥抗寒遺傳基礎(chǔ)，為栽培冬小麥轉(zhuǎn)基因研究提供優(yōu)良抗寒miRNA靶基因源，從而最終為北方地區(qū)栽培冬小麥的改良做出重要貢獻(xiàn)；另一方面也為miRNA代謝機(jī)制的深入研究提供重要信息。
　　 本研究以東農(nóng)冬麥1號(hào)分為試驗(yàn)材料，在大

2、田自然降溫條件下，分別于5℃、-15℃和-25℃三個(gè)不同低溫下取材分蘗節(jié)，采用HiSeq技術(shù)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序片段長(zhǎng)度經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行Rfam(10.1)、Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)和重復(fù)序列篩選，最后把所有的得到的片段進(jìn)行注釋分類，找到三個(gè)溫度點(diǎn)的所有miRNA，包括已知和未知miRNA.。對(duì)已知miRNA進(jìn)行分析，首先進(jìn)行堿基偏向性分析，構(gòu)建三個(gè)溫度時(shí)間點(diǎn)miRNA表達(dá)譜，然后進(jìn)行miRNA差異分析，并構(gòu)建miRNA差異表達(dá)譜，然后對(duì)已知

3、的miRNA進(jìn)行表達(dá)差異分析和家族分析；對(duì)未知的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，包括堿基偏向性分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，未知miRNA的表達(dá)差異分析和靶基因預(yù)測(cè)，最后預(yù)測(cè)其未知miRNA的功能。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.小麥Small RNA測(cè)序數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用Solexa測(cè)序得到序列長(zhǎng)度為10-35nt的小RNA片段，其中文庫(kù)中數(shù)量最多的小RNA是24nt和21nt，最終在5℃、-15℃、-25℃三個(gè)溫度條件下獲得

4、的潔凈reads總量分別是10024183、9448982和10868683。
　　 將reads片段與Rfam(10.1)和Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，去除其中可能的rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA。剩下的reads片段通過(guò)重復(fù)序列比對(duì)去除不同類型的重復(fù)序列，最后經(jīng)sRNA分類注釋篩選，獲得三個(gè)不同溫度下篩選出的miRNA總數(shù)分別為1299843、1167152和1544325。
　　 2.在冷誘

5、導(dǎo)下小麥中已知miRNA鑒定及差異表達(dá)分析
　　 構(gòu)建小麥已知miRNA表達(dá)譜。在小麥miRBase中的已知miRNA有44個(gè)，在東農(nóng)冬麥1號(hào)三個(gè)樣品中(分別為5℃、-15℃、-25℃下取樣分蘗節(jié))分別發(fā)現(xiàn)有35、29和31個(gè)，分析小麥保守miRNA閱讀框的數(shù)量后，發(fā)現(xiàn)這些miRNA的表達(dá)頻率差異很大，其中11個(gè)miRNA出現(xiàn)的序列次數(shù)相對(duì)較高。在差異分析中發(fā)現(xiàn)5個(gè)與冷誘導(dǎo)有關(guān)的miRNA，分別是tae-miR156、tae-m

6、iR398、tae-miR160、tae-miR444和tae-miR444b。tae-miR156的表達(dá)豐度最高，有下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；tae-miR398明顯上調(diào)表達(dá)且差異顯著；tae-miR160顯著下調(diào)表達(dá)；tae-miR444和tae-miR444b皆為顯著下調(diào)表達(dá)。根據(jù)差異表達(dá)分析和已有報(bào)道的靶基因分析，本研究推測(cè)以上五個(gè)miRNA與東農(nóng)冬麥1號(hào)抗寒有關(guān)。
　　 3.東農(nóng)冬麥1號(hào)中的部分已知miRNA鑒定及差異表達(dá)分析

7、r>　　 東農(nóng)冬麥1號(hào)在冷誘導(dǎo)下發(fā)現(xiàn)了567個(gè)已知miRNA，其中發(fā)生顯著或極顯著差異表達(dá)的共164個(gè)，我們選擇其中的30個(gè)miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，在東農(nóng)冬麥1號(hào)中篩選獲得了4個(gè)差異表達(dá)的已知miRNA，其中3個(gè)與花發(fā)育有關(guān)，分別是Tae-miR168、Tae-miR166、Tae-miR172；5個(gè)與冷誘導(dǎo)有關(guān)，分別是Tae-miR393、Tae-miR169、Tae-miR397、Tae-miR319和Tae-miR165；6

8、個(gè)功能未知miRNA，但由冷誘導(dǎo)產(chǎn)生、豐度高，且差異顯著的已知的miRNA，分別是Tae-miR5565、Tae-miR5029、Tae-miR5070、Tae-miR5139、Tae-miR5218和Tae-miR3704。
　　 4.預(yù)測(cè)新的miRNA
　　 本研究在三個(gè)低溫時(shí)間點(diǎn)上共發(fā)掘出378個(gè)新的小麥miRNA，其中5℃下獲得124個(gè)，-15℃下獲得96個(gè)，-25℃下獲得125個(gè)。三個(gè)低溫點(diǎn)分別預(yù)測(cè)到的靶基因數(shù)

9、分別是89個(gè)、7個(gè)8和99個(gè)。在預(yù)測(cè)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選表達(dá)量大、均一化處理后表達(dá)差極顯著的miRNA，最終在東農(nóng)冬麥1號(hào)中篩選出了14個(gè)新miRNA。通過(guò)建立預(yù)測(cè)新miRNA表達(dá)譜，并利用Mireap軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這14個(gè)miRNA都具有代表性的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對(duì)選擇的14個(gè)新miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，其中7個(gè)預(yù)測(cè)到了靶基因，另7個(gè)沒(méi)有預(yù)測(cè)到靶基因。本研究對(duì)感興趣的3個(gè)新miRNA進(jìn)行了靶基因分析，初步預(yù)測(cè)了這3個(gè)新miRNA的功能是