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1、研究背景:膽道閉鎖(BA)是發(fā)生在嬰幼兒期的嚴(yán)重肝臟疾病之一,可導(dǎo)致肝內(nèi)外膽道不同程度的纖維化閉鎖?;純荷蟛痪镁蜁?huì)出現(xiàn)阻塞性黃疸的癥狀,如不及時(shí)診治可引起嚴(yán)重的膽汁淤積和迅速發(fā)展的肝硬化,隨即出現(xiàn)肝脾腫大、腹水、靜脈曲張、凝血功能障礙等門脈高壓征象和肝功能失代償,最終需接受肝移植。疏通膽道、恢復(fù)膽汁流的肝門空腸吻合術(shù)(Kasai術(shù),葛西術(shù))則是延長(zhǎng)患兒自體肝生存、等待肝移植的姑息治療手段。但Kasai術(shù)強(qiáng)調(diào)早期診斷和早期治療,若術(shù)齡超
2、過(guò)90天,膽汁引流失敗率會(huì)明顯升高,與肝移植之間的間隔時(shí)間明顯縮短。近幾年我國(guó)大陸地區(qū)雖然每年已有相當(dāng)多膽道閉鎖患兒接受了Kasai術(shù),但是與國(guó)際上相比,我們的自體肝生存率前景堪憂。盡可能早的對(duì)BA患兒做出正確的診斷一直以來(lái)是小兒外科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
然而,直至目前為止臨床上并未發(fā)現(xiàn)能確診BA的單獨(dú)檢查方法,現(xiàn)有的一些BA特異的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(r-GT、TB、DB等)和影像學(xué)檢查(B超、CT、ERCP、MRCP等)都無(wú)法將B
3、A與其它嬰幼兒膽汁淤積性疾病相鑒別,如何進(jìn)行早期無(wú)創(chuàng)診斷仍是未解的難題。
近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA可作為多種疾病的診斷標(biāo)志物,同時(shí)研究顯示在BA患兒以及BA動(dòng)物模型中皆存在miRNA表達(dá)與調(diào)控異常,提示miRNA可能參與BA的發(fā)病。研究人員用miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-200/429家族在BA患兒血清中高表達(dá),提示miR-200/429家族可作為BA的診斷標(biāo)志物。本研究擬采用Illumina下一代高通量測(cè)序技術(shù)(
4、NGS)篩選出BA特異性的miRNA表達(dá)譜,找出BA循環(huán)miRNA候選診斷標(biāo)志物,為BA的無(wú)創(chuàng)性診斷提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)為BA的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路和線索。
目的:用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)BA患兒和正常對(duì)照組血漿miRNA進(jìn)行測(cè)序,構(gòu)建BA與對(duì)照組間miRNA文庫(kù)。比較BA和對(duì)照組間miRNA的表達(dá)差異,從而構(gòu)建BA特異性血漿循環(huán)miRNA表達(dá)譜。并進(jìn)一步找出具有BA診斷性生物標(biāo)志的miRNA,為尋找新的無(wú)創(chuàng)診斷標(biāo)
5、志物和發(fā)病機(jī)制研究提供依據(jù)。
方法:
1.用Illumina二代高通量測(cè)序平臺(tái)Hiseq2000對(duì)BA患兒的血漿樣本混合池和正常對(duì)照組血漿樣本混合池的miRNA進(jìn)行深度測(cè)序分析;
2.應(yīng)用生物信息學(xué)分析BA患兒與健康嬰幼兒對(duì)照組中血漿miRNA的表達(dá)差異,構(gòu)建BA患兒特征性的miRNA表達(dá)譜;
3. RT-PCR擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證BA特異性miRNA在BA組,膽汁淤積性疾病對(duì)照組和正常對(duì)照組間的差異表
6、達(dá),用2-ΔΔCt表示miRNA的相對(duì)表達(dá)量;
4.采用ROC曲線評(píng)估BA特異性miRNA在BA診斷中的應(yīng)用價(jià)值;
5.用相關(guān)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miRNA的靶基因和相關(guān)信號(hào)通路。
結(jié)果:
1. BA血漿miRNA差異表達(dá)分析
應(yīng)用高通量測(cè)序分析,在BA組和正常對(duì)照組中,發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異在2倍以上的miRNA有146個(gè),其中15個(gè)miRNA歸一化后的表達(dá)量大于1000,7個(gè)上調(diào),8個(gè)下調(diào),這1
7、5個(gè)miRNA構(gòu)成BA循環(huán)miRNA表達(dá)譜。有6個(gè)miRNA歸一化后的表達(dá)量大于5000,分別是表達(dá)上調(diào)的miR-122-5p,miR-100-5p和表達(dá)下調(diào)的miR-140-3p、miR-10b-5p、miR-26a-5p、miR-126-3p。
2.RT-PCR擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證BA特異性miRNA的差異表達(dá)
針對(duì)測(cè)序結(jié)果篩選出的BA特異性miRNA,采用RT-PCR對(duì)44例BA患兒,20例膽汁淤積性疾病對(duì)照組患兒和
8、20例正常對(duì)照組的血漿miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。與正常對(duì)照相比,miR-122-5p和miR-100-5p在BA患兒組血漿中的表達(dá)上調(diào);miR-140-3p和miR-126-3p在BA患兒血漿中表達(dá)下調(diào),與測(cè)序結(jié)果一致,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。與正常對(duì)照組相比,miR-122-5p和miR-100-5p在膽汁淤積性疾病對(duì)照組中的表達(dá)量高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BA組與正常對(duì)照組和膽汁淤積性疾病對(duì)照組相比,miR-140-3p
9、在BA中表達(dá)下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-10b-5p和miR-26a-5p在三組之間表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
3. ROC曲線評(píng)估BA特異性miRNA在BA診斷中的應(yīng)用價(jià)值
根據(jù)測(cè)序結(jié)果和RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果,發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在BA中特異性表達(dá)。miR-140-3p在評(píng)估44例BA與40例非BA人群(包括膽汁淤積性疾病和健康人群)的曲線下面積(AUC)為0.75,95%置信區(qū)間為0.644-0.856,p值
10、<0.001。當(dāng)最佳截?cái)嘀担╟ut-off值)為0.083時(shí),特異度為79.1%,靈敏度為66.7%。
4. BA特異性miRNA的靶基因預(yù)測(cè)
采用靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到miR-140-3p的靶基因FGF9、MMP家族、IGF-1R、PDGF、CTGF、TGF-βR1、Notch2、Wnt5A等與BA相關(guān),這些靶基因參與膽管的發(fā)育和分化、肝纖維化的發(fā)生、細(xì)胞外基質(zhì)的形成等。
結(jié)論:
1.本研究利用二
11、代高通量測(cè)序技術(shù)成功構(gòu)建了BA差異性miRNA表達(dá)譜,這些差異表達(dá)的miRNA與膽管的發(fā)育分化、細(xì)胞外基質(zhì)的形成、肝纖維化的發(fā)生相關(guān)。其中部分miRNA為之前已研究發(fā)現(xiàn)的miRNA,部分為本研究新發(fā)現(xiàn)的miRNA。
2.通過(guò)采用stem-loop RT-PCR方法擴(kuò)大樣本量對(duì)表達(dá)豐度高、個(gè)體間表達(dá)穩(wěn)定的6個(gè)差異miRNA進(jìn)行單個(gè)樣本驗(yàn)證分析,其中miR-122-5p、miR-100-5p、miR-140-3p、miR-126-
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