高溫脅迫引起的棉花雄性不育中small RNA高通量測(cè)序分析及microRNA功能驗(yàn)證.pdf

1、高溫引起的雄性不育現(xiàn)象在植物中普遍存在，同時(shí)也是影響棉花蕾鈴脫落的重要因素。在全球氣候變暖的影響下，頻繁出現(xiàn)的持續(xù)高溫天氣對(duì)棉花產(chǎn)量及品質(zhì)均有極大影響。持續(xù)的高溫會(huì)引起棉花雄性器官的發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為:花藥不開(kāi)裂，花絲縮短和小孢子敗育等。雖然高溫誘導(dǎo)的棉花雄性不育現(xiàn)象早已發(fā)現(xiàn)，然而其形成的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。目前，棉花生產(chǎn)上所用的大多數(shù)品種對(duì)持續(xù)高溫的耐受性都較弱，耐高溫的棉花品種相對(duì)較少，因此培育耐高溫的棉花品種具有重要的應(yīng)

2、用價(jià)值。本研究通過(guò)small RNA測(cè)序?qū)Ω邷啬褪苄兔藁ㄆ废怠?4021’和高溫敏感型棉花品系‘H05’高溫處理前后的不同發(fā)育時(shí)期的花藥進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了大量參與高溫響應(yīng)的small RNA，并對(duì)其中的miRNA進(jìn)行進(jìn)一步的研究。首先篩選獲得參與高溫脅迫影響棉花花藥發(fā)育的miRNA，并用qRT-PCR對(duì)測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行miRNA的表達(dá)分析。隨后，利用降解組測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行miRNA靶標(biāo)的鑒定，以獲得miRNA的靶標(biāo)。為了研究

3、miRNA在高溫脅迫引起的棉花雄性不育中的作用，本研究對(duì)響應(yīng)高溫脅迫的兩個(gè)miRNA(miR157和miR160)進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)基因，并鑒定其在高溫脅迫下棉花花藥發(fā)育中的功能。本研究取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1、在正常溫度條件下，幼嫩的棉花花蕾(3-4 mm)發(fā)育到開(kāi)花所需要的時(shí)間大約在25天左右。棉花花藥的四分體時(shí)期(TS)大約經(jīng)歷2-3天，距離開(kāi)花的時(shí)間為17-19天;絨氈層降解時(shí)期(TDS)大約需要1周，距離開(kāi)花的時(shí)間為6-

4、13天;花藥開(kāi)裂期(ADS)持續(xù)2天，且距離開(kāi)花只有2天。花藥發(fā)育在絨氈層降解完成后，花蕾長(zhǎng)度有1天短暫的停滯期，隨后花蕾長(zhǎng)度快速伸長(zhǎng)，并且花藥發(fā)育會(huì)在1-2天進(jìn)入花藥開(kāi)裂期。由于敏感型棉花品系在高溫處理大約1周左右出現(xiàn)雄性敗育的表型，因此通過(guò)花藥發(fā)育時(shí)期與開(kāi)花時(shí)間的關(guān)系可以推測(cè)出花藥發(fā)育對(duì)高溫敏感的時(shí)期可能是四分體時(shí)期和絨氈層降解期。
　　2、利用small RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)正常溫度和高溫脅迫下高溫耐受型棉花品系‘84021’和

5、高溫敏感型棉花品系‘H05’的2個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（TS和TDS）的16個(gè)花藥樣品（包含2個(gè)生物學(xué)重復(fù)）進(jìn)行small RNA分析。從測(cè)序結(jié)果中共鑒定到112個(gè)已知的miRNA和270個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA，通過(guò)進(jìn)一步篩選獲得27個(gè)表達(dá)豐度較高且響應(yīng)高溫脅迫的miRNA。隨后通過(guò)qRT-PCR對(duì)small RNA測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并在‘84021’和‘H05’中對(duì)部分候選miRNA進(jìn)行表達(dá)分析，通過(guò)測(cè)序及表達(dá)驗(yàn)證，篩選獲得了一些參與高溫響應(yīng)

6、以及花藥發(fā)育的miRNA，如miR156/157，miR160，miR167，miR172等，為后續(xù)研究miRNA在花藥發(fā)育及高溫響應(yīng)中的作用提供數(shù)據(jù)支持。
　　3、利用降解組測(cè)序技術(shù)，對(duì)‘84021’和‘H05’在正常溫度和高溫條件下的4個(gè)花藥降解組文庫(kù)進(jìn)行miRNA靶標(biāo)的鑒定，共獲得76個(gè)miRNA的347個(gè)靶標(biāo)基因，包含528個(gè)靶標(biāo)剪切位點(diǎn)。隨后通過(guò)RLM-RACE以及qRT-PCR的方法對(duì)降解組鑒定到的靶標(biāo)剪切位點(diǎn)以及靶標(biāo)

7、的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)miRNA可以對(duì)降解組中鑒定到的相應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行剪切，同時(shí)表達(dá)分析也顯示大多miRNA的表達(dá)與靶標(biāo)的表達(dá)呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。由此，鑒定到大量與花藥發(fā)育及高溫響應(yīng)相關(guān)的miRNA靶標(biāo)，為棉花花藥發(fā)育及高溫響應(yīng)中miRNA的功能鑒定提供了良好的基礎(chǔ)。
　　4、本研究發(fā)現(xiàn)在棉花中超量表達(dá)miR160抑制了花藥中miR160靶標(biāo)基因ARF10和ARF17的表達(dá)，增加了棉花花藥開(kāi)裂過(guò)程對(duì)高溫的敏感性，具體表現(xiàn)為超表達(dá)m

8、iR160棉花株系的花藥在高溫脅迫5天時(shí)出現(xiàn)花藥不開(kāi)裂但花粉活性正常的表型。為了進(jìn)一步證明miR160在生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)控高溫脅迫影響花藥育性中的功能，本研究在高溫條件下進(jìn)行了外源生長(zhǎng)素處理的實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下外源生長(zhǎng)素可以引起棉花的雄性不育，同時(shí)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)miR160及其靶標(biāo)的表達(dá)均受高溫和外源生長(zhǎng)素噴施的影響，因此證明miR160的表達(dá)同時(shí)受到高溫和生長(zhǎng)素信號(hào)的調(diào)控。進(jìn)一步研究表明，在正?；蛘吒邷貤l件下，肼胝

9、質(zhì)合成的關(guān)鍵基因Cals5的表達(dá)在miR160超表達(dá)系和對(duì)照中無(wú)顯著差異，其與miR160在高溫處理5天時(shí)花粉可育的表型相一致。另外，高溫條件下miR160超表達(dá)系中JA合成相關(guān)基因DAD1、OPR3、LOX4的表達(dá)均比對(duì)照要低，其可能是高溫條件下miR160超表達(dá)系花藥不開(kāi)裂的原因。因此本人推測(cè)miR160超表達(dá)抑制了生長(zhǎng)素信號(hào)抑制型轉(zhuǎn)錄因子ARF10和ARF17的表達(dá)，從而激活了生長(zhǎng)素信號(hào)，激活的生長(zhǎng)素信號(hào)隨后抑制了JA的合成，最終

10、導(dǎo)致miR160超表達(dá)系的花藥在高溫脅迫下不能開(kāi)裂引起雄性敗育。
　　5、正常溫度下，miR157超表達(dá)棉花植株表現(xiàn)出植物器官變小，花期提前的表型。本研究對(duì)棉花miR157超表達(dá)株系進(jìn)行高溫處理后發(fā)現(xiàn)，超量表達(dá)miR157同樣增加了花藥對(duì)高溫的敏感性，表現(xiàn)為花藥不開(kāi)裂和花粉敗育。對(duì)miR157及其靶標(biāo)的qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示，miR157受高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且在正常和高溫條件下，超表達(dá)植株中miR157的表達(dá)量都顯著高于對(duì)照