基于高通量測(cè)序的核酸編碼技術(shù)研究及其在miRNA分析中的應(yīng)用.pdf

1、核酸編碼技術(shù),是指人為對(duì)核酸序列(包含核苷酸單體)的序列排布、修飾的方式和種類等進(jìn)行設(shè)計(jì),使核酸序列具有攜帶額外信息的能力。高通量測(cè)序技術(shù)作為一種快速而有效的序列測(cè)定技術(shù),自2005年問(wèn)世以來(lái)在生命科學(xué)研究中扮演著越來(lái)越重要的角色。然而,較低的樣本并行分析能力制約了高通量測(cè)序技術(shù)在以miRNA樣本為代表的較低復(fù)雜度樣本中的應(yīng)用,同時(shí),較長(zhǎng)的測(cè)序運(yùn)行時(shí)間也影響該技術(shù)得到更廣泛應(yīng)用。核酸編碼技術(shù),通過(guò)對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)使用的核酸序列和核苷酸單

2、體進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造,為高通量測(cè)序技術(shù)性能的提升提供了一條新的思路。本論文以高通量測(cè)序技術(shù)中的核酸序列和核苷酸單體為研究對(duì)象,旨在提升高通量測(cè)序的技術(shù)指標(biāo),特別是樣本并行分析能力和測(cè)序運(yùn)行時(shí)間,拓寬高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用范圍。
　　 1.用于SOLiD測(cè)序平臺(tái)的miRNA文庫(kù)制備方法研究現(xiàn)有的基于SOLiD高通量測(cè)序平臺(tái)的miRNA文庫(kù)制備方案,由于使用一對(duì)雙鏈接頭,在文庫(kù)制備的同一步驟加入反應(yīng)體系,會(huì)在測(cè)序文庫(kù)中產(chǎn)生較高數(shù)量的接頭自

3、連接序列。本論文對(duì)該方案進(jìn)行了改進(jìn),采用一對(duì)單鏈RNA接頭,分別只具有5'末端和3'具有連接活性。接頭分兩輪連接到miRNA樣本的兩側(cè),每輪連接反應(yīng)僅使用一條接頭,每步連接之后應(yīng)用凝膠電泳對(duì)文庫(kù)進(jìn)行長(zhǎng)度選擇和純化。研究結(jié)果表明,改進(jìn)后的方案減少了71％的接頭自連接序列,為利用SOLiD測(cè)序平臺(tái)研究miRNA提供了更加高效的研究方法。
　　 2.雙標(biāo)簽編碼的高通量測(cè)序miRNA文庫(kù)制備方法研究在一張測(cè)序芯片上,高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)能

4、夠并行分析超過(guò)10億個(gè)DNA片段。這使得高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于諸如miRNA這類較低復(fù)雜度的樣本(較低測(cè)序通量需求)時(shí)顯得不夠高效和經(jīng)濟(jì)。針對(duì)這一問(wèn)題,發(fā)展了雙核酸標(biāo)簽編碼的樣本制備技術(shù),該技術(shù)在測(cè)序樣本的兩側(cè)各設(shè)計(jì)了一條核酸標(biāo)簽,利用這對(duì)核酸標(biāo)簽編碼確定樣本信息。使用12種標(biāo)簽完成了對(duì)32個(gè)miRNA樣本的并行分析。研究結(jié)果表明,雙標(biāo)簽編碼方案能夠制備可靠的miRNA文庫(kù),特別適用于大量樣本的并行分析。
　　 3.雙標(biāo)簽編碼mi

5、RNA測(cè)序方法的生物信息學(xué)研究雙標(biāo)簽編碼的miRNA測(cè)序方法面臨如何選擇合適的核酸編碼標(biāo)簽,如何快速高效地從測(cè)序數(shù)據(jù)中挖掘有用信息等生物信息學(xué)挑戰(zhàn)。針對(duì)這些挑戰(zhàn),設(shè)計(jì)了一組長(zhǎng)為6位的核酸標(biāo)簽序列,開(kāi)發(fā)了一套適用于雙標(biāo)簽編碼的數(shù)據(jù)處理流程,重點(diǎn)研究了解碼流程和miRNA歸一化方法。研究結(jié)果表明,所提供的115種核酸標(biāo)簽序列能夠準(zhǔn)確分辨標(biāo)簽種類;所設(shè)計(jì)的解碼流程可實(shí)現(xiàn)對(duì)雙標(biāo)簽編碼方案測(cè)序結(jié)果的精確解碼;經(jīng)比較,分位數(shù)-分位數(shù)法具有更好的歸一

6、化效果。
　　 4.基于雙標(biāo)簽編碼的乳腺癌相關(guān)樣本miRNA表達(dá)研究乳腺癌是全世界婦女最常見(jiàn)的癌癥,為了研究miRNA在乳腺癌樣本的表達(dá)情況,基于高通量測(cè)序的雙標(biāo)簽編碼miRNA文庫(kù)制備方案和數(shù)據(jù)處理流程,研究了乳腺癌相關(guān)樣本的miRNA表達(dá)情況。在對(duì)miRNA進(jìn)行篩選后,共發(fā)現(xiàn)22種miRNA在26個(gè)乳腺癌樣本和6個(gè)乳腺良性組織樣本間存在表達(dá)水平差異。這一篩選為后續(xù)研究乳腺癌與miRNA的相關(guān)性奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　

7、 5.信號(hào)組合編碼的測(cè)序探針技術(shù)研究現(xiàn)有的使用熒光基團(tuán)標(biāo)記測(cè)序探針(包含核苷酸單體)的測(cè)序平臺(tái)中,大多采用最基本熒光基團(tuán)與測(cè)序探針一對(duì)一和一對(duì)多的編碼方式,只能在一輪反應(yīng)中測(cè)定一位堿基的序列信息。設(shè)計(jì)了信號(hào)組合編碼的測(cè)序探針?lè)桨?對(duì)多種標(biāo)記物進(jìn)行組合后,采用每種組合方式標(biāo)記一種或一類核酸序列(包括核苷酸單體)。在迷你測(cè)序證明了方案的可行性,并表明信號(hào)組合編碼方案能夠應(yīng)用于高通量測(cè)序平臺(tái)。該方法是目前國(guó)際上唯一可以在一輪測(cè)序反應(yīng)測(cè)定2位堿