RNA-Seq分析鹽逆境下棉花種子萌發(fā)基因表達動態(tài)變化.pdf

1、棉花(Gossypium hirsutum L.)是我國最重要的農(nóng)作物之一，是農(nóng)民增收和滿足國民經(jīng)濟發(fā)展需求的重要戰(zhàn)略性物資。萌發(fā)是種子生命周期的起始，對植物生命歷程具有決定性的作用，然而外界環(huán)境變化對種子萌發(fā)具有關鍵性的影響。我國6.7％以上的耕地為鹽堿地，相比其它作物，棉花對土壤鹽堿的耐受力相對較高，但含鹽量0.3%以上的土壤仍嚴重抑制棉花種子的萌發(fā)，影響其成苗率，從而成為棉花鹽堿地種植的關鍵限制因素。近年來，由于氣候變化加劇，土壤

2、鹽堿化加重，加之棉花產(chǎn)區(qū)向鹽堿程度較高的東部沿海和西北內陸地區(qū)集中，鹽害脅迫已經(jīng)成為棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要限制因素。本研究利用我國棉花主栽品種柯字棉73為研究材料，通過分析不同鹽濃度下的萌發(fā)率，確定0.6%和0.8% NaCl作為實驗濃度，利用RNA-Seq分析種子萌發(fā)過程中基因表達動態(tài)變化。結合轉錄組數(shù)據(jù)和生物信息學分析，主要獲得如下的結果：
　　1)萌發(fā)實驗表明，外界鹽濃度為0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0

3、%、1.2%、2.0%時，柯字棉種子萌發(fā)率依次為：100.00%、83.33%、73.33%、66.67%、46.67%、10.00%、0.00%、0.00%。外界鹽濃度高于1.0%時，棉花種子幾乎不能萌發(fā)。結合棉花實際栽培環(huán)境常遇到的鹽害濃度，選取0.6%和0.8%鹽濃度作為轉錄組實驗濃度。
　　2) RNA-Seq共獲得114,139,977條clean reads，其中87%的clean reads可以比對到陸地棉基因組序列

4、，以|log2(fold change)|>1（2倍以上差異表達）和 FDR≤0.001為標準，共獲得26650個差異表達的基因(Differentially expressed genes, DEGs)。
　　3)分析表明，隨著鹽處理時間的延長，差異表達基因數(shù)目逐漸上升；而不同鹽濃度下，同一時間點0.8% NaCl處理樣本差異表達基因明顯高于0.6%NaCl濃度。不同萌發(fā)時間點比較，0% NaCl對照組、0.6% NaCl和0.

5、8%NaCl條件下，4h和0h相比較差異基因的個數(shù)依次為：1483、315和869；8h和4h相比，差異基因個數(shù)依次為：1603、1613和942；24h和8h相比較，差異基因依次為：13625、4604和3885。相同時間點，不同鹽濃度處理下，和對照組相比較，0.6%和0.8%NaCl濃度條件下差異表達基因分別為：4h，914(0.6%)和1529(0.8%)；8h，625(0.6%)和1146(0.8%)；24h，10649(0.6

6、%)和15552(0.8%)。以上數(shù)據(jù)表明種子萌發(fā)過程，不同時間點發(fā)生著不同的生理變化，需要不同類型和數(shù)量的基因調控；而萌發(fā)過程對不同濃度的鹽逆境存在相同和相異的表達調控。
　　4)轉錄因子在生物學發(fā)育、逆境響應等過程都有重要的調控作用。本實驗共有74個家族、1053個轉錄因子編碼基因表達發(fā)生顯著性的變化，包括ERF(138)、bHLH(103)、WRKY(93)、NAC(66)、ARF(51)、GATA(48)、MYB(44)、

7、HSF(36)、Trihelix(35)等；而且這些轉錄因子在不同的時間點呈現(xiàn)不同的分布，比如4h時主要的差異轉錄因子為ERF(38)、WRKY(28)、GATA(12)等，8h時主要為WRKY(16)、HSF(12)、ERF(11)等，而24h時主要為ERF(90)、bHLH(63)、WRKY(59)等，說明種子萌發(fā)不同的時期需要不同的轉錄因子調控，而很多轉錄因子又具有相對特異性的調控功能。很多轉錄因子成員被研究報道參與植物逆境下萌發(fā)

8、或發(fā)育等調控或響應，進一步證明這些轉錄因子在逆境條件下種子萌發(fā)中具有重要的生物學功能。
　　5)根據(jù)基因連續(xù)時間表達特征，利用K-mean分析可以將差異表達基因分為30個聚類。對不同聚類的基因進一步GO發(fā)現(xiàn)：聚類7、8、10與轉錄過程、DNA修復、RNA加工和泛素介導的蛋白質降解有關；聚類21主要富集細胞信號轉導途徑；聚類1、6、12、14主要富集碳水化合物代謝、物質運輸、微管運動、新陳代謝過程；聚類4、5主要與逆境應答過程相關；

9、聚類15、20、24、28主要參與翻譯過程；而聚類2、13主要參與蛋白質磷酸化過程。
　　6) Pathway分析表明，萌發(fā)后4h、8h、24h三個時間點，0.6% NaCl濃度下表現(xiàn)出差異的基因有54個，pathway顯著富集在糖代謝通路，PFP酶和PFK酶有顯著差異。0.8%NaCl濃度下表現(xiàn)出差異的基因有168個，pathway富集結果顯示次生代謝物的生物合成、谷胱甘肽代謝、蛋白質加工、糖酵解/葡萄糖途徑、碳代謝有顯著差異。

10、兩個濃度下都有差異的基因有17個。
　　7)對差異基因在A-、D-亞基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，差異基因中，A-亞基因組表達的基因有12990個，包括509個轉錄因子；D-亞基因組表達的基因有13384個，包括534個轉錄因子。對這些基因pathway分析發(fā)現(xiàn)他們大多富集在相似的代謝途徑。此外，A-亞基因組有8960個同源基因、D-亞基因組有9008個同源基因表達。以上結果表明，棉花A-亞基因組和D-亞基因組對棉花耐鹽響應不具有明顯的差異