P(LLA-CL)-絲素納米紗制備及其在組織工程纖維環(huán)中的實驗研究.pdf

1、背景:
　　椎間盤退變性疾病(disc degeneration disease,DDD)是引起腰背部疼痛的主要原因,是臨床上常見病和多發(fā)病。它不僅給社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),而且嚴(yán)重影響人們的正常生產(chǎn)和生活。目前的主要治療方法包括物理、藥物和手術(shù)等治療方法。其中物理和藥物治療主要是對癥治療,緩解癥狀;手術(shù)治療主要是切除退變的椎間盤組織,但不能修復(fù)重建椎間盤的生物學(xué)功能和退變結(jié)構(gòu)。隨著再生醫(yī)學(xué)的興起,運用組織工程技術(shù)構(gòu)建的組織工程椎

2、間盤能夠從結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上完全再生修復(fù)損傷的椎間盤組織,為椎間盤退變性疾病的治療提供了一種新的思路。纖維環(huán)是椎間盤的重要組成部分,構(gòu)建組織工程纖維環(huán)是椎間盤組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,支架材料是構(gòu)建組織工程椎間盤纖維環(huán)的基礎(chǔ)。因而,支架材料的選取和構(gòu)建方式在纖維環(huán)組織工程研究中具有重要的意義。
　　目的:
　　利用新的靜電紡絲方法,制備與天然纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)相似的、三維取向、大孔隙率的聚乳酸-聚己內(nèi)酯/絲素納米紗支

3、架,檢測該支架的理化性能,進(jìn)一步評估兔纖維環(huán)細(xì)胞復(fù)合該支架體外初步構(gòu)建組織工程纖維環(huán)的生物學(xué)特性。
　　方法:
　　1.在傳統(tǒng)靜電紡絲技術(shù)基礎(chǔ)上,采用動態(tài)-水流接收系統(tǒng)制備靜電紡絲聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物( P(LLA-CL))/絲素納米紗三維支架;以傳統(tǒng)靜電紡絲方法制備的P(LLA-CL)/絲素?zé)o規(guī)則納米纖維支架和 P(LLA-CL)/絲素取向納米纖維支架作為對照組;
　　支架材料理化性能檢測:表面形態(tài)觀察;纖維(紗線

4、)直徑、孔徑和孔隙率檢測;傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)和力學(xué)性能測試。
　　2.兩步酶消化法分離培養(yǎng)兔纖維環(huán)細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),通過Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定纖維環(huán)細(xì)胞表型;
　　3.纖維環(huán)細(xì)胞復(fù)合三組支架構(gòu)建組織工程纖維環(huán),在體外培養(yǎng)14d,進(jìn)行如下檢測:CCK-8法檢測粘附、增殖情況;
　　SEM觀察細(xì)胞在三組支架材料上的生長形態(tài);
　　HE染色及激光共聚焦(LSCM)檢測評估細(xì)胞在支架材

5、料上生長滲透情況;
　　采用實時定量PCR檢測組織工程纖維環(huán)中Ⅰ、Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)基因的表達(dá)情況;
　　羥脯氨酸試劑盒檢測組織工程纖維環(huán)中羥脯氨酸含量;
　　組織工程纖維環(huán)行力學(xué)性能檢測。
　　結(jié)果:
　　1.三種靜電紡絲P(LLA-CL)/絲素支架的理化性能:
　　(1)無規(guī)則納米纖維支架的納米纖維無方向性,取向納米纖維支架的納米纖維呈取向性排列;納米紗中的紗線呈取向性排列

6、;
　　(2)無規(guī)則納米纖維的纖維直徑為(460±75)nm,孔徑為(4.41±1.87)μm,孔隙率為(71.47±6.42)％;取向納米纖維的纖維直徑為(471±77)nm,孔徑為(4.41±1.87)μm,孔隙率為(70.7±6.45)%;納米紗纖維纖維直徑為(456±64)nm,紗線的直徑為(13.20±4.16)μm,孔徑為(31.93±15.48)μm,孔隙率為(87.16±4.27)%;組成三種支架的納米纖維的直徑?jīng)]

7、有明顯變化;P(LLA-CL)/絲素納米紗支架相對于對照組,它的孔徑明顯增大、孔隙率也顯著增高,并具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);
　　(3)傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果:在P(LLA-CL)紅外光譜圖中1756 cm-1處有一很強的吸收峰,為C=O伸縮振動吸收,表明P(LLA-CL)含有酯基。絲素光譜圖中1652 cm-1和1639 cm-1處有兩個較強的吸收峰,分別為絲素蛋白的酰胺I和酰胺Ⅱ的吸收峰,而在絲素和 P(LLA

8、-CL)中的三處特征性吸收峰均能在三種支架材料的紅外光譜中觀察到,其中酰胺I和酰胺Ⅱ在三種支架材料紅外光譜明顯減弱,這與絲素蛋白含量的多少有關(guān);
　　(4)力學(xué)性能檢測結(jié)果:無規(guī)則納米纖維支架的斷裂強度為(3.0±0.12)MPa;伸長率為(88.56±4.9)%,彈性模量為(55.98±9.05)MPa;取向納米纖維支架平行方向斷裂強度為(10.6±0.21)MPa;伸長率為(18.79±0.91)%,彈性模量為(184.77±

9、7.75)MPa,其垂直方向的斷裂強度為(1.65±0.11)MPa;伸長率為(122.52±9.34)%,彈性模量為(17.4±0.77)MPa;納米紗支架平行方向斷裂強度為(7.31±0.96)MPa;伸長率為(48.67±5.1)%,彈性模量為(70.58±10.66)MPa,其垂直方向的斷裂強度為(1.09±0.1)MPa;伸長率為(38.67±10.61)%,彈性模量為(15.08±0.47)MPa;平行和垂直方向上納米紗支架

10、的斷裂強度和彈性模量均低于取向納米纖維支架,但平行方向上納米紗支架的斷裂強度和彈性模量均高于無規(guī)納米纖維支架,并具有顯著性差異(P<0.05)。
　　2.消化分離纖維環(huán)細(xì)胞,單層培養(yǎng);倒置顯微鏡下觀察纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài)呈多角形、不規(guī)則形或紡錘形;免疫組化染色觀察結(jié)果Ⅰ、Ⅱ型膠原均見陽性表達(dá),胞漿呈棕黃色,胞核未見染色;
　　3.組織工程纖維環(huán)的大體觀察、細(xì)胞相容性檢測、組織學(xué)評估、纖維環(huán)相關(guān)基因表達(dá)分析以及生物力學(xué)檢測:

11、　　(1)大體觀察:形態(tài)上類似天然椎間盤纖維環(huán)結(jié)構(gòu);
　　(2)4d后,SEM觀察顯示細(xì)胞在無規(guī)則納米纖維支架上呈多角形并無方向性,在取向納米纖維及納米紗支架上呈紡錘形并沿著納米纖維或紗線的方向伸展;7d后細(xì)胞幾乎鋪滿三種支架的表面并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì);
　　(3)CCK-8結(jié)果表明了細(xì)胞能夠良好地粘附在三種支架上;4d和7d后細(xì)胞增殖明顯,在納米紗支架上的細(xì)胞相對于另兩組增殖活性明顯增強;
　　(4)HE染色、LSC

12、M觀察結(jié)果,細(xì)胞只能在無規(guī)則納米纖維支架和取向納米纖維支架的表面生長,而細(xì)胞能夠沿著納米紗支架中紗線方向生長并遷移滲透入支架內(nèi);
　　(5)實時定量PCR檢測結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時間的增加,細(xì)胞在三種支架上Ⅰ、Ⅱ型膠原和Aggrecan基因表達(dá)水平以及羥脯氨酸含量均增高,而在納米紗支架上增高更明顯;均有顯著性差異(P<0.05);
　　(6)生物力學(xué)性能測試結(jié)果顯示:接種細(xì)胞前和接種細(xì)胞7d和14d后,無規(guī)則納米纖維支架和取向納

13、米纖維支架的力學(xué)性能逐漸增強,但無統(tǒng)計學(xué)差異明顯差別;納米紗支架在接種細(xì)胞前與接種14d后相比,力學(xué)性能增加,具有顯著性差異(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在傳統(tǒng)靜電紡絲基礎(chǔ)上,采用動態(tài)-水流系統(tǒng)接收系統(tǒng)制備的靜電紡絲P(LLA-CL)/絲素納米紗支架擁有三維取向的高孔隙率的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),又具有良好的力學(xué)性能,在組織工程椎間盤纖維環(huán)研究中具有應(yīng)用潛力。
　　2.納米紗纖維直徑近似于天然纖維環(huán)膠原纖維,具有取向性能,