絲素蛋白基共混納米纖維的制備及在軟組織修復(fù)中的應(yīng)用.pdf

1、在生命系統(tǒng)中，細胞外基質(zhì)在調(diào)控細胞行為中起著重要的作用，為細胞的黏附、增殖、遷移和分化提供具體的配體。作為組織工程的支架材料，最佳的設(shè)計應(yīng)該盡可能地仿生天然細胞外基質(zhì)。人體內(nèi)細胞外基質(zhì)是由膠原蛋白和糖氨聚糖(GAGs)交聯(lián)而成的納米纖維凝膠網(wǎng)絡(luò)，纖維直徑為50-500nm。靜電紡絲可以制備幾十納米到幾微米的超細纖維，制備的納米纖維支架可以仿生天然細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，具有高的比表面積、高的孔隙率，有利于細胞的黏附、增殖、遷移和分化。絲素蛋白

2、是一種資源豐富的天然蛋白質(zhì)，由于其具有良好的生物相容性、生物可降解性、良好的透氣、透濕性、無免疫原性等優(yōu)異的性能被廣泛用于組織工程領(lǐng)域。然而單一組分的絲素蛋白納米纖維脆性大，柔韌性差，作為用于軟組織修復(fù)（如皮膚、血管、神經(jīng)導(dǎo)管等）的支架材料，難以滿足其力學(xué)性能的要求，尤其對于力學(xué)性能要求較高的血管和神經(jīng)導(dǎo)管等管狀支架。同時，作為組織修復(fù)的支架材料，最佳的設(shè)計應(yīng)該是從結(jié)構(gòu)、組成上仿生細胞外基質(zhì)，進而實現(xiàn)功能上仿生。
　　本課題從仿生

3、天然細胞外基質(zhì)的角度出發(fā)，首先采用靜電紡的方法制備了絲素蛋白(SF)/羥丁基殼聚糖(HBC)共混納米纖維并對其性能進行了研究。掃描電鏡(SEM)顯示隨著共混物中HBC的含量從20％增加到100％，纖維的直徑逐漸減小。通過紅外光譜(FTIR)、13CCP/MAS核磁共振(13CCP/MASNMR)分析，發(fā)現(xiàn)SF與HBC分子間存在一定的相互氫鍵作用，然而HBC的加入沒有誘導(dǎo)SF的構(gòu)象從無規(guī)線團轉(zhuǎn)變成β-折疊結(jié)構(gòu)。X-射線衍射(XRD)分析發(fā)

4、現(xiàn)SF與HBC共混后，出現(xiàn)了新的結(jié)晶峰，且結(jié)晶度提高，進一步說明HBC和SF分子間有一定的相互氫鍵作用。熱重分析(Tg)的結(jié)果表明與純的HBC靜電紡納米纖維膜相比較，共混后熱穩(wěn)定性有所提高。靜電紡納米纖維膜的親水性隨著共混物中HBC含量的增加而減小，但仍保持良好的親水性能。力學(xué)性能的結(jié)果表明，當(dāng)SF和HBC的質(zhì)量比為20∶80時，斷裂強度和斷裂伸長率都明顯地提高，力學(xué)性能有所改進。
　　為了改善SF/HBC共混納米纖維膜在體內(nèi)和體

5、外的穩(wěn)定性，用京尼平蒸氣作為交聯(lián)劑，戊二醛和乙醇蒸氣作比較，對SF/HBC共混納米纖維膜進行了交聯(lián)并對其性能進行了研究。通過對交聯(lián)后以及在去離子水中浸泡4天后的靜電紡納米纖維膜的SEM觀察，結(jié)果表明京尼平蒸氣交聯(lián)的合適時間為24h，同時，戊二醛蒸氣交聯(lián)24h后的纖維膜也具有良好的水抵抗性，而乙醇蒸氣處理24h后的靜電紡纖維膜浸泡后不能保持纖維的結(jié)構(gòu)。孔徑和孔隙率的測試結(jié)果表明京尼平蒸氣和戊二醛蒸氣交聯(lián)的納米纖維膜比乙醇蒸氣處理的納米纖維

6、膜平均孔徑和孔隙率要大。不同質(zhì)量比的SF/HBC共混納米纖維膜用京尼平蒸氣交聯(lián)后，應(yīng)變都稍有下降，應(yīng)力都有明顯地提高，且比相同條件下戊二醛蒸氣交聯(lián)、乙醇蒸氣處理后的力學(xué)性能更好。交聯(lián)后共混納米纖維膜的親水性略有下降。衰減全反射傅立葉紅外光譜(FTIR-ATR)和13CCP/MASNMR表征結(jié)果顯示京尼平和戊二醛都能作為交聯(lián)劑與SF和HBC發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，且京尼平能使SF的構(gòu)象從無規(guī)線團轉(zhuǎn)變成β-折疊。
　　通過內(nèi)皮細胞在不同質(zhì)量比的

7、SF/HBC納米纖維膜支架的增殖情況及細胞形貌觀察對細胞相容性進行了評價，結(jié)果表明細胞在純的SF和不同質(zhì)量比的SF/HBC納米纖維膜支架的增殖速率高于或接近培養(yǎng)板(TCP)。而純的HBC納米纖維支架略差一些。從長時間細胞培養(yǎng)來看，京尼平蒸氣交聯(lián)的SF/HBC納米纖維膜支架比戊二醛蒸氣交聯(lián)更有利于細胞的增殖。SEM觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞能在純的SF及不同質(zhì)量比的SF/HBC納米纖維支架上更好的黏附和擴散。京尼平蒸氣交聯(lián)的SF/HBC納米纖維膜支

8、架作為皮膚缺損修復(fù)動物實驗的結(jié)果表明其具有良好體內(nèi)相容性，能促進傷口的愈合。從長遠考慮，京尼平也許是一種交聯(lián)SF/HBC共混靜電紡納米纖維更理想的方法。
　　由于SF和HBC都是天然材料，共混后力學(xué)性能仍然較差，難以滿足力學(xué)性能要求較高的血管、神經(jīng)導(dǎo)管等管狀支架的要求。因而將SF與力學(xué)性能優(yōu)良的聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物(P(LLA-CL)(50∶50)共混靜電紡成納米纖維。SEM的結(jié)果顯示纖維直徑隨著P(LLA-CL)含量的增加而增

9、大，在共混比例相同時纖維直徑隨溶液總濃度的增加而逐漸增大。通過X-射線光電子能譜(XPS)、FTIR及固態(tài)13CCP/MASNMR分析表明SF主要分布于纖維的表而，并且SF和P(LLA-CL)沒有發(fā)生明顯的共價鍵作用，仍保持了為細胞提供結(jié)合位點的生物功能基團。隨著SF含量的逐漸增加，納米纖維膜的親水性逐漸增強，與純SF及P(LLA-CL)納米纖維膜相比較，SF/P(LLA-CL)共混納米纖維膜的力學(xué)性能得到明顯地改善，且可以通過兩者的比

10、例裁剪以滿足不同支架材料的力學(xué)性能的需要。
　　在模擬體內(nèi)環(huán)境37℃PBS緩沖液（7.4±0.1）的條件下，對SF/P(LLA-CL)共混納米纖維膜的體外降解性能進行了探討。通過對降解不同時間后納米纖維膜的失重、降解液的pH值變化、納米纖維膜的形貌觀察、熱分析(DSC、TG)、XRD及FTIR-ATR等一系列的分析和表征，研究結(jié)果表明純的SF靜電紡纖維膜基本上不降解，純的P(LLA-CL)靜電紡纖維膜降解最快。同時，SF/(PLL

11、A-CL)共混靜電紡纖維膜的降解研究發(fā)現(xiàn)SF的加入，使P(LLA-CL)的降解速率降低。其主要原因可能是SF與P(LLA-CL)存在較強的分子間相互作用力阻礙了P(LLA-CL)分子鏈的運動。
　　以內(nèi)皮細胞為種子細胞，研究了SF/P(LLA-CL)共混納米纖維膜的細胞相容性，而且以新西蘭兔為動物模型，采用皮下植入法，研究了不同比例SF/P(LLA-CL)共混納米纖維膜在體內(nèi)的組織相容性。MTT結(jié)果顯示，含有SF的納米纖維支架比純

12、的P(LLA-CL)納米纖維支架更有利于內(nèi)皮細胞的黏附，并且與純的P(LLA-CL)納米纖維支架相比，SF/P(LLA-CL)共混納米纖維支架更能促進內(nèi)皮細胞的增殖，尤其當(dāng)SF/P(LLA-CL)的比例為25∶75時，更有利于內(nèi)皮細胞的生長。SEM觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞在共混納米纖維上能更好的擴散形成內(nèi)皮單層。皮下植入實驗的結(jié)果說明不同比例的SF/P(LLA-CL)共混納米纖維支架具有良好的體內(nèi)組織相容性。
　　采用高速旋轉(zhuǎn)滾筒接收裝置

13、制備了取向SF/P(LLA-CL)(25∶75)納米纖維并研究了其與雪旺細胞的相互作用。滾筒旋轉(zhuǎn)速率對纖維取向度及直徑影響的研究發(fā)現(xiàn)，隨著旋轉(zhuǎn)速率的逐漸增加，取向度逐漸增大，而纖維直徑?jīng)]有明顯的變化。力學(xué)性能測試的結(jié)果表明，取向納米纖維膜的力學(xué)性能存在各向異性，在纖維平行方向的斷裂應(yīng)力比纖維垂直方向的斷裂應(yīng)力大的多。對雪旺細胞在取向、無規(guī)的靜電紡纖維膜上的增殖和細胞形態(tài)進行了研究。增殖實驗的結(jié)果表明雪旺細胞在SF/P(LLA-CL)取向

14、和無規(guī)靜電紡纖維上增殖均高于取向和無規(guī)的P(LLA-CL)靜電紡纖維上的增殖，且細胞在取向SF/P(LLA-CL)納米纖維上的增殖要高于無規(guī)SF/P(LLA-CL)納米纖維上的增殖。通過SEM觀察細胞的形貌，結(jié)果顯示在取向SF/P(LLA-CL)納米纖維上細胞是沿著纖維方向生長和拉長，并且細胞與細胞之間及細胞與纖維之間很好地融合在一起，而在其它纖維上細胞呈現(xiàn)為所有方向上擴散的形貌。說明取向SF/P(LLA-CL)納米纖維的拓撲結(jié)構(gòu)能引導(dǎo)

15、細胞沿著纖維的方向生長。
　　以SD大鼠作為動物模型，取向SF/P(LLA-CL)(25∶75)納米纖維制成的神經(jīng)導(dǎo)管用于橋接大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損。P(LLA-CL)納米纖維制成的神經(jīng)導(dǎo)管和自體神經(jīng)作為對照組。術(shù)后4周和8周從大體觀察、電生理檢測、組織學(xué)和免疫組織學(xué)分析以及圖像分析等指標檢測比較各組坐骨神經(jīng)再生的情況。所有的結(jié)果均表明:取向SF/P(LLA-CL)納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管組再生神經(jīng)纖維的質(zhì)量和數(shù)量均優(yōu)于取向P(LLA-