羥基磷灰石-納米微晶纖維素-絲素蛋白復合支架的制備及其用于顱骨修復的研究.pdf

1、骨的主要無機成分為羥基磷灰石(hyd roxyapatite，HA)，在眾多生物材料中，由于納米HA的形貌，成分，晶型和結(jié)晶度與天然骨中的骨礦物非常相似，因此其具有好的骨誘導性、骨傳導性和骨整合性，成為大塊骨缺陷再生方面的研究熱點。此外，當HA與其他材料復合，例如天然高分子，制備成復合支架時，HA能夠通過增加支架的表面特性及其粗糙度，從而促進骨細胞的活力和其增殖，有利于骨缺損部位的修復。另外，納米材料是21世紀的研究熱點，將現(xiàn)有的物質(zhì)制

2、備成納米粒子，物質(zhì)就會顯示出不一樣的性質(zhì)，能夠賦予材料新的性能。納米級的骨組織修復材料具有自固化成型、機械強度高等特點，無毒無污染，優(yōu)異的降解性能。納米羥基磷灰石具有良好的生物相容性，能夠誘導骨組織的生長發(fā)育，與骨組織細胞能夠形成牢固的結(jié)構(gòu)。但是羥基磷灰石的韌性不強，力學性能差，降解性能差。因此，將HA粒子與天然高分子復合制備成骨組織工程支架，能夠結(jié)合天然高分子與HA粒子的優(yōu)點，彌補雙方的不足。
　　納米微晶纖維素(cellulo

3、se nanocrystals，CNC)，是纖維素的衍生物，一般是通過濃硫酸水解纖維素的方法而制得，其中纖維素是自然界最普遍，最豐富的生物聚合物。納米微晶纖維素，由于其納米級尺寸（在至少一個維度），也常常被稱為晶須，納米晶須，納米顆粒，納米纖維，微晶或微晶粒。一般來說納米微晶纖維素的寬度為2-50nm，長度為100-2000nm，具有較大的比表面積、高強度，低密度、在溶液中良好的分散性、天然無毒性、可降解，良好生物和細胞相容性等特點，同

4、時可以被用作脫鈣骨基質(zhì)的載體，并在體內(nèi)實驗中取得良好結(jié)果。然而，粉末狀的HA和CNC的低抗壓強度限制了它們在非或低承重骨修復上的應用。為了提高HA和CNC的抗壓強度，在制造功能支架時使HA和CNC納米粒子在聚合物基質(zhì)中均勻分布是傳統(tǒng)的方法。陳等人制備了生物活性玻璃/殼聚糖/CMC復合材料水凝膠用于骨再生。結(jié)果表明，復合水凝膠有止血效果，并且它的生物降解性可引導骨缺陷的功能性重建。
　　絲素蛋白（silk fibroin，SF），從

5、蠶繭中提取的一種天然高分子，擁有極好的機械強度，生物相容性，長期生物降解性以及易加工性，而且成本低廉，來源豐富。絲素蛋白是具有β片層構(gòu)象的線性多肽，由于其低免疫原性、良好的生物性功能和易加工性，經(jīng)常在組織工程中使用。最近有研究表明，絲素蛋白中的納米尺寸的蛋白對生物礦化有調(diào)節(jié)作用，這是由于絲素蛋白結(jié)構(gòu)中的雙層片狀結(jié)構(gòu)存在排斥力。另外，隨著絲素蛋白濃度的增加，會逐漸改變了納米羥基磷灰石的形態(tài)。這特征使得絲素蛋白在骨缺損的修復材料中，能夠充當

6、生物礦化的模板。許多人研究了HA/SF支架用作骨缺損修復材料的可能性，結(jié)果表明HA/SF支架是一種促進骨再生的很好的材料。
　　研究表明，具有納米拓撲結(jié)構(gòu)的人工骨支架在骨再生領(lǐng)域中具有巨大的潛力。另外，在之前的研究當中，納米羥基磷灰石，納米微晶纖維素、絲素蛋白其中一種或兩種的復合材料已經(jīng)廣泛在骨再生領(lǐng)域中被研究或應用;但是將三種材料復合，制備成復合支架用于骨再生領(lǐng)域，還沒有發(fā)現(xiàn)有學者進行相關(guān)的研究和報道。因此，在本研究中，我們的目

7、的是設計一種新型的生物仿生支架用于顱骨的全層缺損修復，該支架主要采用納米非金屬材料（納米羥基磷灰石），天然高分子（納米微晶纖維素）和蠶繭的提取物（絲素蛋白），通過一系列的制備，復合辦法，并且在不添加生長因子和干細胞的情況下，制備一種具有骨誘導、骨引導，納米拓撲結(jié)構(gòu)和可降解功能的生物仿生支架。
　　第一部分 納米羥基磷灰石肭米微晶纖維素/絲素蛋白復合支架的制備與表征
　　目的:
　　在不添加生長因子和干細胞的情況下，制備

8、一種具有良好骨誘導和骨引導，并且可降解，生物相容性良好的骨修復組織工程支架。
　　方法:
　　首先采用水熱法合成納米羥基磷灰石，酸解法制備納米微晶纖維素，通過蠶繭提取絲素蛋白，制備絲素蛋白溶液。隨后通過物理共混和冷凍干燥的辦法，制備復合支架，并對其進行一系列的表征。
　　結(jié)果:
　　在本研究中，我們首先通過水熱合成法制備了針形結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石顆粒，該顆粒呈針形結(jié)構(gòu)，長度為100-300 nm，寬度為20-30

9、 nm。其次，通過酸解法，利用纖維素制備了納米微晶纖維素，該納米微晶纖維素呈短棒狀，長度約為150-350nm，寬度約為20-40nm，而且結(jié)構(gòu)規(guī)整。隨后，我們將納米HA，CNC和SF溶液，經(jīng)過簡單的物理共混，將HA和CNC均勻分散在絲素蛋白溶液中，隨后通過冷凍干燥的方法，制備了HA/CNC/SF多孔復合支架。該復合支架的微孔分布均勻，孔與孔之間的連通性好，而且孔徑比較均一，平均孔徑為110μm，孔隙率為90％左右，有利于成骨細胞的粘附

10、，增殖和分化。另外，HA/CNC/SF支架具有良好的熱穩(wěn)定性和力學性能，壓縮應力和壓縮模量分別為200.7±15.3和617.5±25.2KPa。另外，通過細胞相容性測試可以知道，四種SF支架都具有良好的細胞相容性，而HA/CNC/SF支架更加有利于成骨細胞的增殖。另一方面，在堿性磷酸酶(Alkaline phosphatise，ALP)的活性測試中，HA/CNC/SF支架上的小鼠原成骨細胞(MC3T3-E1)的堿性磷酸酶活性表達顯著高

11、于其他三種SF支架，證明了HA/CNC/SF支架能夠更有效地促進原成骨細胞的體外成骨分化。
　　結(jié)論:
　　本研究制備的HA/CNC/SF支架具有良好的骨誘導和骨引導能力，而且細胞相容性良好，具有修復骨缺損的潛力。
　　第二部分 SF支架對大鼠顱骨全層缺損的修復
　　雖然骨有自我修復的能力，但是當骨缺損的面積超過一定的尺寸，骨的自我修復能力就大大地受到了限制，甚至是沒法自我修復。因此，對于大面積的骨缺損，需要植入

12、骨修復材料，對大面積的缺損部位進行修復。標準化的動物模型有利于我們研究復合材料對骨缺陷修復的情況。根據(jù)文獻的報道，對于大鼠來說，當其顱骨的骨缺損區(qū)的直徑在超過5mm的時候，該缺陷是該物種在特定的骨頭沒法自我修復的。
　　目的:
　　檢驗我們制備的HA/CNC/SF復合支架對大鼠的顱骨全層缺損模型（直徑為6mm）的骨缺損的修復效果。
　　方法:
　　在制造了大鼠的顱骨缺損后，將HA/CNC/SF復合支架移植到大鼠的

13、顱骨缺損部位。為了對比，我們也分別將SF、CNC/SF、HA/CNC/SF支架移植到大鼠的顱骨缺損部位。在特定的時間點（移植術(shù)后4W、8W、12W），采用Micro-CT測定缺損區(qū)大體修復情況、骨密度情況和組織學染色研究缺損部位新骨形成的情況。
　　結(jié)果:
　　通過Micro-CT的3D重建效果圖，可以很直觀地看到，隨著時間的增加，四種支架對缺損部位的修復情況不一，其中SF組的修復情況最差，經(jīng)過12周的修復，全層缺損的顱骨部

14、位依舊殘留很大的缺損部位沒有被修復好，而其它三個組別，缺損部位的面積均較前有較明顯的減小，其中HA/CNC/SF組的修復情況最理想，缺損部位被大量新生骨填充，幾乎完全修復，而HA//SF組及CNC/SF缺損面積也較小，缺損處新生骨組織填充較多。另外，通過BMD數(shù)值分析可以得知，隨著時間的增加，四個實驗組的骨密度有所增加，其中HA/CNC/SF組的骨密度值最大，而且與正常骨的骨密度接近。另一方面，通過組織學的HE和番紅固綠分析得知，在植入

15、期間，HA/CNC/SF支架不會引起缺損部位炎癥反應，具有良好的生物相容性，而且新生的骨組織已經(jīng)長入支架孔內(nèi)，這說明HA/CNC/SF具有良好的骨誘導和骨引導作用。此外，相對于其他三種SF支架，HA/CNC/SF支架的骨修復效果最好，術(shù)后12周，缺損部位基本完全修復，而且新生骨的形態(tài)與原始骨相似。同時，隨著時間的增加，支架的降解越來越明顯，術(shù)后12周，只有很少量的支架存在，新生的骨與周邊骨組織結(jié)合緊密。
　　結(jié)論:
　　結(jié)果