3T3-L1前脂肪細胞與纖維蛋白凝膠構建組織工程脂肪的體外實驗研究.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)前脂肪細胞并與纖維蛋白凝膠復合，研究前脂肪細胞在纖維蛋白凝膠上的黏附，增殖，誘導分化為脂肪細胞的情況。探索將纖維蛋白凝膠作為前脂肪細胞載體的可行性。為前脂肪細胞和纖維蛋白凝膠復合移植預防硬膜外瘢痕形成提供理論和實踐基礎。 方法：(1)3T3-L1前脂肪細胞株的培養(yǎng)：前脂肪細胞用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃細胞培養(yǎng)箱(5﹪二氧化碳)中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液，傳代擴增至實驗所需細胞數(shù)量。(2)實驗分為兩個

2、階段：1)前脂肪細胞培養(yǎng)階段；2) 誘導分化階段。第一階段實驗分組：A組為前脂肪細胞纖維蛋白凝膠復合組，B組為單純前脂肪細胞對照組。將培養(yǎng)瓶中生長狀況良好處于對數(shù)生長期的前脂肪細胞用0.25﹪的胰酶消化，顯微鏡下計數(shù)并制成密度為1×1O<'5>個/ml的單細胞懸液備用。將纖維蛋白原用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液充分溶解，配制成濃度為75mg/ml的纖維蛋白原溶液，凝血酶用40mmol/L的氯化鈣溶液溶解，配制成濃度為100u/ml的

3、凝血酶溶液。先后向24孔板內加入前脂肪細胞的單細胞懸液100ul、纖維蛋白原溶液200ul和凝血酶溶液100ul，均勻混合后于37℃的細胞培養(yǎng)箱中靜置10分鐘制成前脂肪細胞纖維蛋白凝膠復合物，再另將100ul前脂肪細胞的單細胞懸液加入24孔板內為對照組培養(yǎng)，A、B兩組細胞各24孔。利用倒置相差顯微鏡觀察不同時間點的A、B兩組中前脂肪細胞的黏附、生長、增殖情況。分別于實驗的第1、3、5、7、9、11、13天取A、B兩組各3孔中的前脂肪細胞

4、，采用MTT法檢測細胞的相對數(shù)量。隨機取A、B兩組中各3孔的細胞，向每孔中加入噻唑藍溶液(5mg/ml)100ul后，移入37℃細胞培養(yǎng)箱中靜置4小時，然后吸棄培養(yǎng)孔中的上清液，向每孔再加入10﹪的二甲基亞砜(DMSO)溶液500u1，振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解后，每孔取150ul轉入96孔板中，于570nm波長下測定各孔的光密度(OD)值，統(tǒng)計后繪制A、B兩組中前脂肪細胞的生長曲線。 第二階段實驗分組：C組為前脂肪細胞纖維

5、蛋白凝膠誘導分化組，D組為單純前脂肪細胞誘導分化組，E組為從纖維蛋白凝膠上消化的前脂肪細胞誘導分化組。誘導分化都在24孔板中進行，每組各18孔，每孔接種的前脂肪細胞數(shù)為5×10<'4>個。細胞接種第5天后加入含誘導分化劑(含0.5mmol/L的IMBX、5mg/L的胰島素和1umol/L的地塞米松)的培養(yǎng)液，利用倒置相差顯微鏡觀察C、D、E3組不同時間點前脂肪細胞的分化情況，于誘導分化后第1、6、12天隨機取C、D、E三組中各5孔細胞，

6、采用油紅O染色提取法測定各組中脂肪細胞內的脂肪含量。先將C、D、E組標本用10﹪的中性甲醛固定10分鐘，PBS液漂洗后加入配制好的油紅O染料浸沒標本10分鐘，再用PBS液洗去未著色的油紅O殘渣。然后將已染色的培養(yǎng)板置于37℃細胞培養(yǎng)箱內蒸發(fā)掉板內的水分，隨即每孔加入1ml異丙醇靜置30分鐘，萃取脂肪細胞中的油紅O染料，萃取出的染液用吸管移出，于722型分光光度計510nm波長處測量吸光度，以OD值表示C、D、E3組中脂肪細胞的脂肪的相對

7、含量。 結果：從生長曲線可以看出，A組即復合在纖維蛋白凝膠上的前脂肪細胞具有良好的增殖能力，接種11天后纖維蛋白凝膠上的前脂肪細胞數(shù)高于B組孔板內培養(yǎng)的前脂肪細胞數(shù)(P<0.05)。倒置相差顯微鏡觀察C組即前脂肪細胞纖維蛋白凝膠復合誘導組在加入誘導分化劑10天后可見部分細胞分化為脂肪細胞，而另外D、E兩組在加入誘導劑4天后可見分化的脂肪細胞，E組從纖維蛋白凝膠上消化下來的前脂肪細胞具有與D組孔板中培養(yǎng)前脂肪細胞相當?shù)姆只芰?，?/p>