3T3-L1前脂肪細(xì)胞與纖維蛋白凝膠構(gòu)建組織工程脂肪的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞并與纖維蛋白凝膠復(fù)合，研究前脂肪細(xì)胞在纖維蛋白凝膠上的黏附，增殖，誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞的情況。探索將纖維蛋白凝膠作為前脂肪細(xì)胞載體的可行性。為前脂肪細(xì)胞和纖維蛋白凝膠復(fù)合移植預(yù)防硬膜外瘢痕形成提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。 方法：(1)3T3-L1前脂肪細(xì)胞株的培養(yǎng)：前脂肪細(xì)胞用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱(5﹪二氧化碳)中培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液，傳代擴(kuò)增至實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞數(shù)量。(2)實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)

2、階段：1)前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)階段；2) 誘導(dǎo)分化階段。第一階段實(shí)驗(yàn)分組：A組為前脂肪細(xì)胞纖維蛋白凝膠復(fù)合組，B組為單純前脂肪細(xì)胞對(duì)照組。將培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)狀況良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前脂肪細(xì)胞用0.25﹪的胰酶消化，顯微鏡下計(jì)數(shù)并制成密度為1×1O<'5>個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液備用。將纖維蛋白原用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液充分溶解，配制成濃度為75mg/ml的纖維蛋白原溶液，凝血酶用40mmol/L的氯化鈣溶液溶解，配制成濃度為100u/ml的

3、凝血酶溶液。先后向24孔板內(nèi)加入前脂肪細(xì)胞的單細(xì)胞懸液100ul、纖維蛋白原溶液200ul和凝血酶溶液100ul，均勻混合后于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置10分鐘制成前脂肪細(xì)胞纖維蛋白凝膠復(fù)合物，再另將100ul前脂肪細(xì)胞的單細(xì)胞懸液加入24孔板內(nèi)為對(duì)照組培養(yǎng)，A、B兩組細(xì)胞各24孔。利用倒置相差顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)的A、B兩組中前脂肪細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、增殖情況。分別于實(shí)驗(yàn)的第1、3、5、7、9、11、13天取A、B兩組各3孔中的前脂肪細(xì)胞

4、，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。隨機(jī)取A、B兩組中各3孔的細(xì)胞，向每孔中加入噻唑藍(lán)溶液(5mg/ml)100ul后，移入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4小時(shí)，然后吸棄培養(yǎng)孔中的上清液，向每孔再加入10﹪的二甲基亞砜(DMSO)溶液500u1，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解后，每孔取150ul轉(zhuǎn)入96孔板中，于570nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的光密度(OD)值，統(tǒng)計(jì)后繪制A、B兩組中前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 第二階段實(shí)驗(yàn)分組：C組為前脂肪細(xì)胞纖維

5、蛋白凝膠誘導(dǎo)分化組，D組為單純前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化組，E組為從纖維蛋白凝膠上消化的前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化組。誘導(dǎo)分化都在24孔板中進(jìn)行，每組各18孔，每孔接種的前脂肪細(xì)胞數(shù)為5×10<'4>個(gè)。細(xì)胞接種第5天后加入含誘導(dǎo)分化劑(含0.5mmol/L的IMBX、5mg/L的胰島素和1umol/L的地塞米松)的培養(yǎng)液，利用倒置相差顯微鏡觀察C、D、E3組不同時(shí)間點(diǎn)前脂肪細(xì)胞的分化情況，于誘導(dǎo)分化后第1、6、12天隨機(jī)取C、D、E三組中各5孔細(xì)胞，

6、采用油紅O染色提取法測(cè)定各組中脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量。先將C、D、E組標(biāo)本用10﹪的中性甲醛固定10分鐘，PBS液漂洗后加入配制好的油紅O染料浸沒(méi)標(biāo)本10分鐘，再用PBS液洗去未著色的油紅O殘?jiān)?。然后將已染色的培養(yǎng)板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)蒸發(fā)掉板內(nèi)的水分，隨即每孔加入1ml異丙醇靜置30分鐘，萃取脂肪細(xì)胞中的油紅O染料，萃取出的染液用吸管移出，于722型分光光度計(jì)510nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，以O(shè)D值表示C、D、E3組中脂肪細(xì)胞的脂肪的相對(duì)

7、含量。 結(jié)果：從生長(zhǎng)曲線可以看出，A組即復(fù)合在纖維蛋白凝膠上的前脂肪細(xì)胞具有良好的增殖能力，接種11天后纖維蛋白凝膠上的前脂肪細(xì)胞數(shù)高于B組孔板內(nèi)培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞數(shù)(P<0.05)。倒置相差顯微鏡觀察C組即前脂肪細(xì)胞纖維蛋白凝膠復(fù)合誘導(dǎo)組在加入誘導(dǎo)分化劑10天后可見(jiàn)部分細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，而另外D、E兩組在加入誘導(dǎo)劑4天后可見(jiàn)分化的脂肪細(xì)胞，E組從纖維蛋白凝膠上消化下來(lái)的前脂肪細(xì)胞具有與D組孔板中培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞相當(dāng)?shù)姆只芰Γ?/p>