骨髓間質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實驗研究.pdf

1、目的:理想的人造心臟瓣膜應(yīng)當(dāng)具有天然瓣膜的生物學(xué)結(jié)構(gòu),無免疫源性,具有自我更新和生長能力,耐久性好能終生使用.組織工程心臟瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)具有自體活細胞,能夠自我更新和改建,生物力學(xué)和血流動力學(xué)性能優(yōu)良,耐久性好,無需抗凝,符合理想人造心臟瓣膜的條件.幾年來經(jīng)過眾多研究者的努力,TEHV研制取得了令人矚目的進展,但過度到臨床應(yīng)用尚需在種子細胞、支架材料、構(gòu)建方式及相關(guān)設(shè)備等方

2、面進一步完善.目前構(gòu)建TEHV的種子細胞主要是來源于自體血管壁的成纖維細胞及內(nèi)皮細胞,但從自體血管壁獲取種子細胞不但技術(shù)復(fù)雜,培養(yǎng)周期較長,而且會給機體造成一定創(chuàng)傷,常規(guī)臨床應(yīng)用并不現(xiàn)實;支架材料主要有生物可降解合成聚合物支架和天然瓣膜支架.鑒于現(xiàn)有合成支架材料的性能還達不到構(gòu)建瓣膜組織的要求,而同種心臟瓣膜的來源缺乏,TEHV支架材料的研究仍以去細胞豬主動脈瓣為主.雖然動物實驗證實去細胞異種瓣膜支架的免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)微弱,但臨床試驗

3、已有去細胞豬瓣(SynerGraft瓣)發(fā)生早期衰壞及功能障礙的報道,表明現(xiàn)有的去細胞方法并不理想,必須改進.本研究嘗試采用血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化為血管內(nèi)皮細胞的可行性,以尋找更為便捷可行的種子細胞來源.應(yīng)用低濃度胰酶+表面活性劑脫氧膽酸(de

4、oxycholic acid,DCA)+核酸酶的方法制作去細胞豬主動脈瓣支架,以探索去細胞效果確切而又能有效保留天然瓣膜生物力學(xué)性能的去細胞方法.通過BMSCs分化細胞的種植實驗,進一步考察BMSCs在去細胞支架上生長的生物學(xué)行為,評價用BMSCs構(gòu)建TEHV的可行性.方法:1.綿羊BMSCs的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化研究髂嵴穿刺抽取綿羊骨髓液,Percoll密度梯度離心法獲取BMSCs,DMEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)擴增,采用α-SMA、vimen

5、tin免疫組化染色及α-SMA表達的流式細胞儀(FCM)分析鑒定細胞表型.免疫組化Ⅰ、Ⅲ型膠原染色評價BMSCs分泌膠原的功能.以含表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF),堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰島素樣生長因子(insulinlike growthfactor,IGF)和肝素的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)原代細胞,并以VEGF誘導(dǎo)BMSCs

6、向內(nèi)皮細胞分化.通過CD34、CD31流式細胞儀分析,免疫組化CD34、Ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定內(nèi)皮細胞,荊豆凝集素(ulex europaeus agglutinin,UEA)結(jié)合實驗及一氧化氮(NO)含量測定評價內(nèi)皮細胞功能.2.去細胞豬主動脈瓣膜支架的制備在豬宰殺后20分鐘內(nèi)清潔條件下取出心臟,4℃冰鹽水沖洗.切取主動脈瓣葉或帶瓣主動脈管道.瓣葉采用75﹪酒精消毒2分鐘,主動脈帶瓣管道修剪后30KGray γ射線照射消毒.分別采用0

7、.01﹪胰蛋白酶+核酸酶+1﹪Triton持續(xù)震蕩24小時(組1),0.01﹪胰酶8小時+核酸酶+1﹪DCA持續(xù)震蕩24小時(組2)及1﹪DCA+核酸酶持續(xù)震蕩32小時(組3)三種方法對新鮮豬主動脈瓣葉及帶瓣主動脈管道進行去細胞處理.新鮮瓣葉作為對照(組4).去細胞效果的評價:通過常規(guī)石臘包埋切片HE染色,掃描電鏡及透射電鏡觀察評價去細胞瓣葉的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和去細胞效果.去細胞瓣葉的生物力學(xué)性能評價:應(yīng)用單軸拉伸實驗繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線、應(yīng)力

8、松馳曲線,測定各組瓣葉在應(yīng)力為0.3MPa時的彈性模量,加載-卸載曲線下的面積比,同一應(yīng)力下的伸長比及松馳率.通過拉斷實驗測量各組瓣葉的最大抗張強度及斷裂伸長比.運用Student-t檢驗比較各組去細胞瓣葉的生物力學(xué)指標.去細胞支架的免疫源性及炎性反應(yīng)評價:將去細胞瓣葉及主動脈管道裁剪后植入SD大鼠背部皮下,并分別于包埋2周和4周后取出瓣葉,4周和8周后取出主動脈壁及瓣下肌肉組織,切片HE染色及免疫組化vimentin、α-SMA染色評

9、價去細胞支架的免疫源性、體內(nèi)炎性反應(yīng)及改建情況.3.組織工程心臟瓣膜的體外構(gòu)建采用靜態(tài)、立體及分次種植的方法將BMSCs分化的肌成纖維樣細胞及內(nèi)皮細胞分別種植于去細胞瓣葉及整體主動脈瓣支架上構(gòu)建TEHVs.分別于DMEM和M199全培養(yǎng)液中培養(yǎng)7~8天后取出,通過石臘包埋切片HE染色,掃描及透射電鏡觀察評價TEHVs的組織學(xué)結(jié)構(gòu),考察BMSCs及其分化細胞在去細胞天然瓣膜支架上生長的生物學(xué)行為.免疫組化α-SMA、CD34及Ⅷ因子相關(guān)抗

10、原染色鑒定種植細胞的表型.結(jié)果:1.原代培養(yǎng)的BMSCs貼壁后呈三角形、多角形和梭形,3~5天后呈集落樣生長.傳代細胞為均一梭形,呈指數(shù)增殖,5ml骨髓液分離得到的BMSCs在體外培養(yǎng)擴增2周即可獲取10<'7>~10<'8>個細胞.其自然分化細胞α-SMA、vimentin及Ⅰ、Ⅲ型膠原染色陽性,α-SMA表達水平(平均熒光強度)與血管壁肌成纖維細胞無明顯差異,超微結(jié)構(gòu)示胞漿內(nèi)含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌小泡,提示具有旺盛的分泌功能;B

11、MSCs經(jīng)內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)及VEGF體外誘導(dǎo)2周后分化為內(nèi)皮細胞,呈三角形及多角形,表達CD34和CD31及Ⅷ因子相關(guān)抗原,UEA結(jié)合試驗陽性,培養(yǎng)液中NO含量明顯高于單純擴增培養(yǎng)的BMSCs(29.7±2.78 μ mol vs 15.12±1.34 μ mol P<0.05),與成熟內(nèi)皮細胞相比則無明顯差異(29.7±2.78 μ mol vs 32.21±2.61 μ mol P>0.05).超微結(jié)構(gòu)示細胞內(nèi)可見Weibel-Pa

12、lade小體.2.采用0.01﹪胰蛋白酶+核酸酶+1﹪DCA相結(jié)合的方法(組2)能夠完全去除豬主動脈瓣葉及主動脈壁上的細胞成份,而波浪狀纖維支架結(jié)構(gòu)保存完好.組1和組3未能去除主動脈壁深層的細胞及瓣下肌肉的細胞核成份.各組去細胞瓣葉的最大抗張強度均低于新鮮瓣葉,組2去細胞瓣葉的彈性模量及最大抗張強度大于組1(分別為5.77±0.95 MPa vs 4.15±1.13MPa和7.82±1.51MPa vs 4.65±0.85MPa P<0

13、.05).該組瓣葉應(yīng)力伸長比及斷裂伸長比則小于組1(0.45±0.02 vs 0.60±0.06 P<0.05),與新鮮瓣葉無明顯差異(0.45±0.02 vs 0.46±0.03 P>0.05).提示組2去細胞瓣葉的生物力學(xué)性能優(yōu)于組1.大鼠皮下包埋瓣葉及管道組織切片HE染色示組2去細胞支架的炎癥反應(yīng)輕微,宿主成纖維細胞能夠長入去細胞主動脈瓣葉及管道,并對其進行改建.新鮮瓣葉及組1、組3去細胞支架的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)明顯,支架結(jié)構(gòu)破壞

14、.3.由BMSCs自然分化細胞構(gòu)建的TEHV HE染色示BMSCs分化的肌成纖維樣細胞在去細胞支架上呈復(fù)層生長,細胞間有基質(zhì)形成,免疫組化染色示α-SMA陽性,掃描電鏡檢查示去細胞支架表面為致密細胞層覆蓋,細胞呈梭形,排列有序,細胞間有絲狀纖維相連.透射電鏡示瓣葉表面為長梭形復(fù)層細胞覆蓋,細胞胞漿內(nèi)有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及粗大分泌顆粒,表明細胞合成及分泌功能旺盛.細胞間有基質(zhì)形成.4.誘導(dǎo)分化內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出與成熟內(nèi)皮細胞相同的生物學(xué)行為,由分

15、化內(nèi)皮細胞所構(gòu)建的TEHV組織學(xué)切片HE染色示內(nèi)皮細胞在支架上形成了完整的單細胞層,免疫組化染色示CD34、Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性,掃描電鏡檢查示去細胞支架表面為單層細胞覆蓋,細胞呈梭形,表面光滑,排列有序,細胞間纖維連接較少.透射電鏡示支架表面為單細胞層,胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌顆料較少.5.整體瓣膜支架細胞種植實驗表明BMSCs及誘導(dǎo)分化內(nèi)皮細胞能夠在管道內(nèi)表面及瓣葉主動脈面生長.BMSCs自然分化細胞在管道內(nèi)表面呈復(fù)層均勻生長,而誘導(dǎo)分

16、化內(nèi)皮細胞則在管道內(nèi)表面形成了完整的單細胞層.結(jié)論:1.采用0.01﹪胰酶(8小時)+核酸酶+1﹪DCA相結(jié)合的方法能夠完全去除豬主動脈瓣葉及主動脈壁上的細胞成份,去細胞瓣膜支架的免疫源性大大降低,且纖維支架結(jié)構(gòu)保留完好,生物力學(xué)性能無明顯影響.其去細胞效果優(yōu)于0.01﹪胰酶+1﹪Triton+核酸酶及1﹪DCA+核酸酶的方法.2.BMSCs獲取方便,對機體創(chuàng)傷微小,體外擴增能力強大,5ml骨髓液分離得到的BMSCs在體外培養(yǎng)擴增2周即

17、可獲取10<'7>~10<'8>個細胞,能夠達到構(gòu)建TEHV所需的細胞數(shù)量.BMSCs的自然分化細胞為肌成纖維樣細胞,在去細胞天然瓣膜支架上呈復(fù)層生長,并能夠合成和分泌細胞外基質(zhì).3.在內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)及VEGF的誘導(dǎo)下BMSCs可分化為內(nèi)皮細胞,表達內(nèi)皮細胞表型,并具有內(nèi)皮細胞功能,在去細胞天然瓣膜支架上形成完整的單細胞層.為TEHV提供完整光滑的表面.4.BMSCs分化細胞的生物學(xué)特性與血管壁細胞相似,應(yīng)用BMSCs作為種子細胞去細