組織工程化口腔粘膜體外預構建.pdf

1、組織工程化口腔粘膜是近年來口腔醫(yī)學領域的新熱點，本文通過體外培養(yǎng)口腔粘膜上皮細胞和成纖維細胞，模擬組織工程化三維口腔粘膜的構建，探索組織工程化口腔粘膜體外培養(yǎng)的方法。本研究主要包括以下三方面內容:
　　1.原代細胞培養(yǎng)目的:通過組織塊法結合胰蛋白酶消化法培養(yǎng)、分離人口腔粘膜上皮細胞和成纖維細胞。材料與方法:10例第三磨牙拔除時切除的齦瓣，大小約1×0.5 cm2/塊。將帶有上皮層和固有層的組織塊種植于培養(yǎng)瓶中，待組織塊細胞增殖后，

2、通過胰蛋白酶消化法分離獲得原代上皮細胞和成纖維細胞。通過在不同培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，進一步純化兩種細胞。采用免疫熒光和HE染色進行細胞鑒定。結果:組織塊植入后的第2 d～3 d可看到組織塊周邊出現(xiàn)新分裂增殖的細胞，約14d細胞增殖范圍達到0.5 cm～1 cm后，進行初次傳代。胰蛋白酶消化法可初步分離出上皮細胞和成纖維細胞。結論:組織塊法結合胰蛋白酶消化法能快速高效的培養(yǎng)分離口腔粘膜上皮細胞和成纖維細胞，是一種實用的口腔粘膜細胞培養(yǎng)方法。<

3、br>　　2.支架篩選目的:篩選適合用于組織工程化口腔粘膜體外構建的支架材料。材料與方法:將5組上皮細胞和成纖維細胞分別種植于脫細胞異體真皮基質、PEG、PVA三種生物支架上，培養(yǎng)2d后，采用CCK-8測定細胞活性，采用隨機區(qū)組設計方差分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)。將成纖維細胞種植于三種生物支架上，培養(yǎng)1周后再將上皮細胞種植于支架上，繼續(xù)培養(yǎng)1周，HE染色及免疫組化觀察細胞在支架中的生長狀態(tài)。結果:統(tǒng)計分析顯示，上皮細胞和成纖維細胞活性在三種生物材料中

4、均無明顯的差異(P＞0.05)。HE染色及免疫組化顯示，三種生物支架材料中，脫細胞異體真皮基質中的細胞數(shù)目多，分布層次深，細胞標記蛋白表達較好。結論:三種生物支架中較適宜用于體外三維培養(yǎng)口腔粘膜上皮細胞及成纖維細胞的是脫細胞異體真皮基質。
　　3.組織工程化口腔粘膜體外預構建目的:通過體外三維培養(yǎng)口腔粘膜上皮細胞和成纖維細胞，模擬組織工程化口腔粘膜的構建，探索組織工程化口腔粘膜體外培養(yǎng)的方法。材料與方法:將成纖維細胞種植于脫細胞異

5、體真皮基質上，培養(yǎng)1周后再將上皮細胞種植于支架上，繼續(xù)培養(yǎng)1周后，將支架移至氣-液平面培養(yǎng)5d。HE染色及免疫熒光觀察口腔粘膜上皮細胞與成纖維細胞體外三維培養(yǎng)的情況。結果:免疫熒光及HE染色顯示，經過2周的液下培養(yǎng)及5d的氣-液培養(yǎng)后，細胞可以深入生長植入到支架全層，其中上皮細胞主要集中在支架表層及淺層，成纖維細胞主要分布在支架深層。結論:口腔粘膜上皮細胞及成纖維細胞體外三維培養(yǎng)后細胞的分布狀態(tài)類似于口腔粘膜組織的基本分層，但細胞增殖數(shù)