組織工程化靜脈瓣構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù).pdf

1、原發(fā)性瓣膜功能不全是臨床上常見病，多發(fā)病，靜脈瓣移植被認(rèn)為是最后的選擇。但自體靜脈瓣移植來源有限，限制了靜脈瓣移植的應(yīng)用，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)與工程學(xué)原理開發(fā)出具有生物活性、無免疫原性的組織工程化靜脈瓣是修復(fù)與功能重建深靜脈功能不全的理想方案。
　　 目前構(gòu)建組織工程化靜脈瓣研究處尚處于起步階段。Teebken等(2003)應(yīng)用組織工程學(xué)原理，用受體靜脈壁來源的肌纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建組織工程化靜脈瓣，但是肌纖維母細(xì)胞沒能長入支架內(nèi)

2、部；該課題組在2009年又以人大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，大隱靜脈脫細(xì)胞支架為支架材料，構(gòu)建組織工程化靜脈瓣，三維立體培養(yǎng)8天，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能在瓣膜兩側(cè)和血管壁表面生長并內(nèi)皮化，但該研究血管壁內(nèi)沒種植細(xì)胞，沒有進(jìn)行體內(nèi)移植。
　　 我們實(shí)驗(yàn)室在國家、軍隊(duì)和上海市基金的資助下，近年來一直進(jìn)行組織工程化靜脈瓣的研究，我們已[1]利用骨髓來源的多能成體祖細(xì)胞(Multipotentadultprogenitorcells，MAPC)和內(nèi)皮

3、祖細(xì)胞(Endothelialprigenitorcell，EPC)作為種子細(xì)胞，以綿羊脫細(xì)胞靜脈瓣支架為支架材料，成功構(gòu)建了組織工程化靜脈，并進(jìn)行了犬、綿羊在體效用性研究，及安全性評價(jià)。但是，靜脈瓣在體內(nèi)長期功能欠佳，我們認(rèn)為，其原因可能與瓣膜的內(nèi)皮化程度、內(nèi)皮細(xì)胞體內(nèi)黏附強(qiáng)度、脫細(xì)胞支架材料在制備過程中損傷、變性等因素有關(guān)。擬提高組織工程化靜脈瓣的質(zhì)量，縮短與生理性靜脈瓣的差距，優(yōu)化構(gòu)建程序，有必要對組織工程化靜脈瓣的構(gòu)建中所用材料

4、和構(gòu)建技術(shù)進(jìn)行再探討。
　　 在種子細(xì)胞研究方面，我們實(shí)驗(yàn)室利用骨髓源性MAPC和EPC為種子細(xì)胞，成功構(gòu)建了組織工程化靜脈瓣，但是，細(xì)胞分離培養(yǎng)過程復(fù)雜，需采用全骨髓血培養(yǎng)加免疫磁珠分選，免疫磁珠價(jià)格昂貴、不經(jīng)濟(jì)，細(xì)胞分選過程復(fù)雜，易污染。為優(yōu)化組織工程化靜脈瓣構(gòu)建程序、降低成本，有必要對種子細(xì)胞的種類及分離培養(yǎng)方法進(jìn)行再研究。
　　 在支架材料制備方法上，先前的研究采用了兩種不同的脫細(xì)胞支架制備方法，但其中哪一種方法

5、較好還未曾研究。近期有研究報(bào)道的凍融+生物酶的方法，在其他組織脫細(xì)胞支架制備中對支架材料結(jié)構(gòu)損傷小，但目前該方法還未見在靜脈瓣膜脫細(xì)胞支架制備中應(yīng)用。在支架材料制備方法上，我們先前的研究采用TritonX-100+NH40H+DNase+RNase的脫細(xì)胞方法，支架無細(xì)胞殘留，纖維連續(xù)，支架內(nèi)布滿大小不等的孔隙，無免疫原性。但利用該支架材料構(gòu)建的組織工程化靜脈瓣體內(nèi)長期功能欠佳，這是否與該脫細(xì)胞方法有關(guān)尚不得而知。近期研究報(bào)道，凍融+生

6、物酶的方法在其他組織脫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)對支架材料結(jié)構(gòu)損傷小，利用該方法制備的瓣膜脫細(xì)胞支架是否能提高組織工程化靜脈瓣體內(nèi)長期功能，也值得研究。
　　 在種子細(xì)胞種植方法上，我們先前的研究采用多點(diǎn)注射和加壓灌注的方法，程序復(fù)雜、需要較高的專門技術(shù)、且發(fā)現(xiàn)利用該方法構(gòu)建的組織工程化靜脈瓣體內(nèi)超過6個(gè)月，有內(nèi)皮細(xì)胞脫落、血栓形成的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了組織工程化靜脈瓣的體內(nèi)長期功能，迫切需要尋找新的方法。
　　 本研究針對我們組織工程化靜

7、脈瓣研究中遇到到的問題，擬通過簡化種子細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，獲取活性好，純度高的種子細(xì)胞；獲得一種脫細(xì)胞完全、對支架材料結(jié)構(gòu)損害較小的組織工程化靜脈瓣脫細(xì)胞支架的方法；以及研發(fā)平滑肌細(xì)胞種植器，提高平滑肌細(xì)胞粘附率等三個(gè)方面的研究；以提高組織工程化靜脈瓣的構(gòu)建效果，改善組織工程化靜脈瓣遠(yuǎn)期性能。
　　 第一部分，同時(shí)培養(yǎng)兔骨髓源性EPCs和SPCs
　　 研究目的：
　　 同時(shí)分離和培養(yǎng)兔骨髓來源的EPCs和平滑肌祖

8、細(xì)胞(Smoothprogenitorcells，SPCs)，研究其生物學(xué)特性，評估其作為組織工程化靜脈瓣種子細(xì)胞的可能性。
　　 材料和方法：
　　 密度梯度離心法獲取兔骨髓血單個(gè)核細(xì)胞沉淀，分別用含5％FBS的EGM-2完全培養(yǎng)基向EPC方向誘導(dǎo)培養(yǎng)；用含5％FBS，20ng/mlPDGF-BB，不含VEGF的EBM-2培養(yǎng)基向SPC方向誘導(dǎo)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)48h后首次換液，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，透射電鏡觀察兩

9、類細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。誘導(dǎo)第7天，14天細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞儀檢測EPCs/SPCs表面標(biāo)志陽性率表達(dá)情況；檢測細(xì)胞攝取DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1功能，以及在MatriGel上成血管功能情況，將第3代細(xì)胞進(jìn)行凍存和復(fù)蘇，測定細(xì)胞凍存前后的細(xì)胞活性變化。
　　 結(jié)果：
　　 EPCs生物學(xué)特性：EPCs培養(yǎng)10天左右，細(xì)胞單層融合呈“鋪路石”狀；EPC表達(dá)CD34，VEGFR-2，弱表達(dá)CD133；透

10、射電鏡可見EPCs胞漿內(nèi)特征性W-P小體；細(xì)胞生物學(xué)功能檢測可見EPCs在Matrigel上呈現(xiàn)血管狀；EPCs具有攝取DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1的功能。凍存細(xì)胞復(fù)蘇前后細(xì)胞生長特性方面無明顯變化；SPCs生物學(xué)特性：SPCs培養(yǎng)14天左右出現(xiàn)血管平滑肌特異的生長特征“峰-谷”樣生長特性；表達(dá)CD34，SMA，不表達(dá)Ⅷ和VEGF-2；在透射電鏡下可見細(xì)胞內(nèi)含有與細(xì)胞縱軸平行排列的肌絲；無攝取DiI-ac-LDL和結(jié)合

11、FITC-UEA-1功能；在Matrigel上無血管狀結(jié)構(gòu)形成。
　　 結(jié)論：
　　 骨髓血梯度密度離心得到的單個(gè)核細(xì)胞，在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下，可同時(shí)獲到高純度的EPCs和SPCs，SPCs可自然分化為平滑肌樣細(xì)胞，不需要經(jīng)向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、不易污染。
　　 第二部分，不同方法制備組織工程化靜脈瓣脫細(xì)胞支架
　　 研究目的：
　　 比較三種不同方法制備的帶瓣靜脈脫細(xì)胞支架的組織

12、學(xué)，生物學(xué)特性，以期獲得一種較好的帶瓣靜脈脫細(xì)胞支架材料。
　　 材料和方法：
　　 采用以下三種不同方法制備帶瓣靜脈脫細(xì)胞支架。
　　 1.脫氧膽酸鈉組：Beagle犬帶瓣靜脈，浸入4％去氧膽酸鈉溶液，4℃振蕩1h進(jìn)行脫細(xì)胞處理，然后于37℃以50mL生理鹽水反復(fù)沖洗，得到脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架，于4℃PBS液中保存?zhèn)溆茫?br>　　 2.Triton組：Beagle犬帶瓣靜脈，浸入0.5％Triton-100+

13、0.05％NH40H溶液，4℃振搖3d；超純水4℃振搖3d；DNase+RNase處理(37℃)12h；超純水漂洗，將脫細(xì)胞支架60CO輻照消毒，-80℃保存?zhèn)溆茫?br>　　 3.凍融+生物酶組：Beagle犬帶瓣靜脈，浸入4℃低滲液浸泡11小時(shí)，-80℃3小時(shí)，37℃水浴30min，PBS振蕩沖洗。0.05％胰酶+0.02％EDTA處理8h，DNase0.2mg/mL、Nase0.02mg/mL消化8h，PBS漂洗，上述步驟重復(fù)3

14、次，支架材料冷凍干燥，輻照消毒，-80℃保存?zhèn)溆茫?br>　　 隨機(jī)選取各組支架材料檢測，病理切片分別行HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)；掃描電鏡觀察支架材料表面及內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)；透射電鏡DAPI染色觀察DNA殘留；體外EPCs細(xì)胞種植檢測細(xì)胞相容性。
　　 結(jié)果：
　　 三種脫細(xì)胞方法均能徹底去除細(xì)胞，DAPI熒光檢測顯示各組支架材料細(xì)胞核，均無DNA成分殘留；HE染色及掃描電鏡顯示，凍融+生物酶組膠原纖維排列整齊，未見明顯的膠原

15、纖維結(jié)構(gòu)改變，其他兩組可見膠原纖維斷裂，及結(jié)構(gòu)紊亂現(xiàn)象；與其他兩組脫細(xì)胞支架材料相比凍融+生物酶組支架皮下埋置炎細(xì)胞浸潤較少，EPCs與凍融生物酶組支架材料粘附性好。
　　 結(jié)論：
　　 結(jié)合滲透壓改變的反復(fù)凍融加上低濃度胰酶，核酸酶脫細(xì)胞法，既可以較徹底除去帶瓣膜靜脈細(xì)胞成分，又保留了較完整的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，具有良好的組織和細(xì)胞相容性，是較理想的帶瓣膜靜脈脫細(xì)胞支架制備方法。
　　 第三部分，平滑肌種植器構(gòu)建組

16、織工程化靜脈瓣
　　 研究目的：
　　 研制平滑肌細(xì)胞種植器，并利用該裝置種植SPCs，加壓灌注旋轉(zhuǎn)種植EPCs，以提高細(xì)胞的種植率，構(gòu)建性能良好的組織工程化靜脈瓣。
　　 材料和方法：
　　 平滑肌細(xì)胞種植器的研制：改革傳統(tǒng)的從官腔內(nèi)種植平滑肌細(xì)胞的方法，利用真空吸引的作用將平滑肌細(xì)胞從官腔外壁較均勻的種植平滑肌細(xì)于在內(nèi)膜下。組織工程化靜脈瓣構(gòu)建：選第3代SPCs/EPCs為種子細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組用自制的平滑

17、肌種植器種植SPCs：對照組用加壓灌注多點(diǎn)注射的方法種植SPCs。培養(yǎng)三天后，以加壓灌注種植EPCs，繼續(xù)培養(yǎng)四天。SPCs種植4h，冰凍切片，DAPI染色觀察SPCs種植密度；24h掃描電鏡、甲苯胺藍(lán)染色觀察SPCs在支架材料上的粘附情況；MTT檢測、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測種子細(xì)胞在支架材料內(nèi)的增殖性能。一周后HE染色，免疫組織化學(xué)染色觀察構(gòu)建的組織工程化靜脈瓣的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：
　　 平滑肌種植器種植的細(xì)胞密度較

18、均勻、支架材料內(nèi)膜層結(jié)構(gòu)破壞較小、種植平滑肌細(xì)胞的數(shù)量可進(jìn)行量化控制；在無菌的細(xì)胞懸液筒中進(jìn)行，減少了構(gòu)建過程中的污染幾率。種植4h后DAPI染色顯示，實(shí)驗(yàn)組SPCs種植密度均勻，對照組細(xì)胞種植密度不均勻，僅局部有細(xì)胞聚集。掃描電鏡顯示，實(shí)驗(yàn)組血管外表面細(xì)胞粘附較多，已有少量的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，支架材料表面平滑；對照組有少量細(xì)胞粘附，支架材料表面有蜂窩狀。甲苯胺藍(lán)染色顯示，實(shí)驗(yàn)組SPCs在支架材料上粘附較多，細(xì)胞密度較大。MTT、細(xì)胞粘附