基于脫細胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究.pdf

1、肝臟是人體內(nèi)最大的器官，是物質(zhì)代謝的中樞，在葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝、蛋白合成以及解毒方面都發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)前肝炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病正嚴重威脅著人類健康，全世界由肝疾病引發(fā)的死亡率達到2.5％，其中最嚴重的是肝功能衰竭。我國是世界上病毒性肝炎和肝癌發(fā)病人數(shù)最多的國家，每年因肝病死亡的人數(shù)近50萬，每年用于治療肝炎和肝病的醫(yī)療、保健費用高達1000多億元。急性肝功能衰竭預(yù)后不良，死亡率高達70％～80％。目前，針對急、慢性肝衰竭患者

2、，肝移植是最有效的治療方法，但由于可供移植的肝臟嚴重短缺，大多數(shù)患者在等待供體肝臟的過程中死亡。因此，尋找新的療法或肝臟功能替代品已成為臨床上亟需解決的問題，采用肝臟組織工程技術(shù)體外再造肝臟，有望為肝衰竭提供新的治療手段。
　　組織工程是將工程學(xué)、材料學(xué)與生命科學(xué)的原則應(yīng)用到開發(fā)生物代替物的前沿交叉學(xué)科領(lǐng)域，其核心內(nèi)容是建立三維復(fù)合體，即體外構(gòu)建具有生物學(xué)功能的工程化組織。肝臟組織工程研究始終是組織工程研究的熱點領(lǐng)域之一，在近三十

3、年的發(fā)展過程中，已取得了諸多突破性進展。研究表明，體外再造肝臟具有一定的肝衰竭等肝臟疾病治療作用，系列核心技術(shù)在生物人工肝效能提升與更新?lián)Q代方面發(fā)揮了重要作用。盡管如此，由于肝臟結(jié)構(gòu)與功能的復(fù)雜性，體外構(gòu)建組織工程化肝臟器官仍面臨著一系列挑戰(zhàn)，如支架材料相容性差，且支架材料中缺乏類似于在體的脈管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致再造肝臟體積受限;此外，現(xiàn)有的支架材料結(jié)構(gòu)和組分相對單一，尚不能為肝細胞提供與體內(nèi)環(huán)境類似的微環(huán)境。正因如此，近年來，基于脫細胞基質(zhì)生

4、物材料的肝臟組織工程研究受到了越來越多的關(guān)注，發(fā)展異常迅速，并取得了一批階段性研究成果。
　　脫細胞基質(zhì)是指利用化學(xué)法、物理法或酶解法來破壞組織/器官中的細胞結(jié)構(gòu)，并將細胞碎片從細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中清除而獲得的生物支架材料。利用不同洗脫條件處理后的脫細胞基質(zhì)不僅可以保留組織或器官中的主要細胞外基質(zhì)成分，而且可以使其中的血管系統(tǒng)及超微結(jié)構(gòu)的完整性得到一定保存，因此是一種適應(yīng)細胞生長和組織再

5、生的優(yōu)良材料。脫細胞技術(shù)的迅猛發(fā)展掀起了脫細胞基質(zhì)的研究熱潮。自從2008年Ott等人首次成功制備出心臟全器官脫細胞基質(zhì)以來，研究人員已成功獲得了多種臟器的全器官脫細胞基質(zhì)，如肝臟、腎臟、肺臟等。肝臟作為機體最大的臟器，基于脫細胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究已成為組織工程研究領(lǐng)域的焦點之一。目前，用于肝臟組織工程研究的脫細胞基質(zhì)支架材料主要包括兩類:非肝臟來源的脫細胞基質(zhì)材料和肝臟來源的全器官脫細胞基質(zhì)材料。
　　在基于非肝臟脫

6、細胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，為了拓寬支架材料的來源，國內(nèi)外研究人員致力于探索其他組織來源的非肝臟脫細胞基質(zhì)材料應(yīng)用于肝臟組織工程的可行性。例如，研究人員已成功利用空腸脫細胞基質(zhì)材料構(gòu)建了工程化類肝組織，研究發(fā)現(xiàn)空腸脫細胞基質(zhì)材料能夠支持肝細胞正常的形態(tài)及其代謝活性，表明非肝臟來源的脫細胞基質(zhì)材料能夠應(yīng)用于肝臟組織工程研究。目前，研究其他組織來源的脫細胞基質(zhì)材料對肝細胞的支持作用或構(gòu)建工程化肝臟組織已為成本領(lǐng)域的研究熱點之一。

7、　　大網(wǎng)膜(greater omentum)是連接胃大彎至橫結(jié)腸的腹膜，富有極強的彈性和靈活性，同時具有高度血管化的結(jié)構(gòu)，這些特點使其成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中優(yōu)良的天然材料。目前，大網(wǎng)膜在臨床上主要用于外科重建手術(shù)中對炎性或者缺損組織的修復(fù)，促進組織的再生;在組織工程研究領(lǐng)域，大網(wǎng)膜可作為體外移植構(gòu)建物的“天然生物反應(yīng)器”，促進構(gòu)建物血管化的形成，增強移植構(gòu)建物的功能，已成功應(yīng)用于心肌組織工程、軟骨組織工程、神經(jīng)組織工程等領(lǐng)域。近年

8、來，隨著脫細胞技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究人員在大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)研究中開展了大量研究工作，并成功獲得了大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)支架材料，然而，目前尚未見將大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)應(yīng)用于肝臟組織工程的研究報道。
　　在基于肝臟全器官脫細胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，研究人員已經(jīng)應(yīng)用胎兒肝細胞、原代肝細胞、肝細胞系等多種來源的細胞接種到肝臟脫細胞基質(zhì)中，成功在體外構(gòu)建了具有一定功能的工程化肝臟組織或類器官。研究發(fā)現(xiàn)，與以往的支架材料相比，肝臟脫細胞基質(zhì)能夠為

9、細胞提供更接近于天然肝臟的微環(huán)境。此外，由于細胞外基質(zhì)成分在不同的物種之間具有高度保守性，脫細胞技術(shù)得到的細胞外基質(zhì)支架同時具有低免疫原性的優(yōu)點，因而可以作為工程化肝臟組織構(gòu)建中優(yōu)良的生物支架材料。
　　獲得結(jié)構(gòu)及組成均優(yōu)良的肝臟脫細胞基質(zhì)材料是開展基于脫細胞基質(zhì)肝臟組織工程研究的基礎(chǔ)與前提。目前，肝臟脫細胞基質(zhì)制備方法主要包括物理法、化學(xué)法、酶學(xué)消化法以及上述方法的組合使用等。然而，雖然脫細胞技術(shù)的發(fā)展日新月異，涌現(xiàn)了許多脫細胞

10、方法，但現(xiàn)有脫細胞洗脫方法均存在一定的不足，比如洗脫時間長、ECM成分破壞嚴重、生長因子大量丟失等。理想的制備肝臟全器官脫細胞基質(zhì)的方法尚有待進一步優(yōu)化。
　　基于上述分析，本論文主要從以下三個方面開展研究工作:
　　第一部分:基于大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究
　　目的:研究大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)支架材料的成分組成、生物相容性及其應(yīng)用于肝臟組織工程的可行性。方法:利用免疫組織化學(xué)染色檢測四種大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)(N

11、o.1、2、3、4)的組成，通過掃描電鏡檢測其形態(tài)與孔徑大小;在此基礎(chǔ)上，分別接種大鼠原代分離的肝細胞構(gòu)建工程化肝臟組織片層，并進行肝臟組織工程研究，不同時間點取材，通過Live/Dead染色檢測細胞活性，利用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測工程化組織中肝細胞形態(tài)及生物學(xué)功能。結(jié)果:四種大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)均含有天然ECM中主要蛋白組分并具有

12、典型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中No.1、3基質(zhì)孔徑較小，No.2、4基質(zhì)孔徑較大;肝臟組織工程研究發(fā)現(xiàn)，與小孔徑支架材料相比，大孔徑大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)支架可以更好的支持肝細胞的粘附、生長及支持其糖原儲存、白蛋白分泌等生物學(xué)功能的發(fā)揮。結(jié)論:大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)作為一種優(yōu)良的生物支架材料，能夠維持肝細胞的形態(tài)并支持其生物學(xué)功能，在肝臟組織工程中具有良好的應(yīng)用前景。
　　第二部分:肝臟全器官脫細胞支架材料的制備及條件優(yōu)化
　　目的:對兩種肝臟全

13、器官脫細胞基質(zhì)制備方法進行比較，以期篩選出更為有效的肝臟脫細胞基質(zhì)制備方法。方法:采用兩種不同方案(分別以十二烷基硫酸鈉(SDS)和TritonⅩ-100+SDS(Tx+SDS)為主要洗滌劑）制備肝臟全器官脫細胞基質(zhì)，通過組織學(xué)、分子生物學(xué)等方法檢測基質(zhì)中細胞和核酸成分的去除情況、ECM蛋白組成及生長因子含量。結(jié)果:兩種方法均能達到去細胞化要求;SDS方案得到的脫細胞基質(zhì)脈管網(wǎng)絡(luò)遭到破壞，纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散;Tx+SDS方案得到的脫細胞基

14、質(zhì)脈管結(jié)構(gòu)完整，ECM蛋白和生長因子含量均高于SDS方案。結(jié)論:利用Tx+SDS為主要洗滌的脫細胞方法可成功制備出優(yōu)良的肝臟全器官脫細胞基質(zhì)，為工程化肝臟組織構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分:基于肝臟全器官脫細胞支架材料的肝臟組織工程研究
　　目的:探索以本研究中制備的肝臟全器官脫細胞基質(zhì)為支架材料，構(gòu)建工程化肝臟組織的可行性。方法:以Tx+SDS方案制備肝臟脫細胞基質(zhì)，接種HepG2細胞系構(gòu)建工程化肝組織片層，體外培養(yǎng)7天后

15、取材，利用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、PAS染色研究工程化肝組織的形態(tài)及其生物學(xué)功能。結(jié)果:組織學(xué)染色結(jié)果表明，肝臟脫細胞基質(zhì)支架可以支持細胞的粘附、生長，維持細胞形態(tài)和增殖能力;PAS染色結(jié)果顯示此支架材料能夠支持細胞糖原儲存生物學(xué)功能的發(fā)揮。結(jié)論:Tx+SDS方法制備的肝臟全器官脫細胞支架材料具有良好的生物相容性，可維持細胞形態(tài)并支持其生物學(xué)功能，能夠作為工程化肝臟組織構(gòu)建的優(yōu)良支架材料。
　　綜上所述，本論文在基于非肝臟來源

16、脫細胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，系統(tǒng)比較了四種具有大小兩類不同孔徑的大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)的成分組成，發(fā)現(xiàn)四種大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)均良好的保留有天然ECM主要蛋白成分且具有良好的生物相容性;與小孔徑支架材料相比，大孔徑大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)能夠更好的維持肝細胞形態(tài)并支持其糖原儲存、白蛋白分泌等生物學(xué)功能的發(fā)揮，證實了大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)應(yīng)用于肝臟組織工程的可行性，拓展了肝臟組織工程中脫細胞基質(zhì)支架材料的來源。在基于肝臟全器官脫細胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方

17、面，本論文首先比較研究了兩種制備肝臟全器官脫細胞基質(zhì)的洗脫方案，研究發(fā)現(xiàn)與SDS方案相比，Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細胞基質(zhì)可以保留天然肝臟的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、脈管結(jié)構(gòu)完整性，并能更好的保留ECM基本組分。其次，以Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細胞基質(zhì)為支架材料構(gòu)建工程化肝臟組織，發(fā)現(xiàn)工程化組織中細胞能夠維持良好的形態(tài)并能夠發(fā)揮生物學(xué)功能，表明以Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細胞基質(zhì)具有良好的生物學(xué)性能，能夠作為工程化肝臟組織構(gòu)建