基于脫細胞基質支架材料的肝臟組織工程研究.pdf

1、肝臟是人體內最大的器官，是物質代謝的中樞，在葡萄糖代謝、脂質代謝、蛋白合成以及解毒方面都發(fā)揮著重要的作用。當前肝炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病正嚴重威脅著人類健康，全世界由肝疾病引發(fā)的死亡率達到2.5％，其中最嚴重的是肝功能衰竭。我國是世界上病毒性肝炎和肝癌發(fā)病人數(shù)最多的國家，每年因肝病死亡的人數(shù)近50萬，每年用于治療肝炎和肝病的醫(yī)療、保健費用高達1000多億元。急性肝功能衰竭預后不良，死亡率高達70％～80％。目前，針對急、慢性肝衰竭患者

2、，肝移植是最有效的治療方法，但由于可供移植的肝臟嚴重短缺，大多數(shù)患者在等待供體肝臟的過程中死亡。因此，尋找新的療法或肝臟功能替代品已成為臨床上亟需解決的問題，采用肝臟組織工程技術體外再造肝臟，有望為肝衰竭提供新的治療手段。
　　組織工程是將工程學、材料學與生命科學的原則應用到開發(fā)生物代替物的前沿交叉學科領域，其核心內容是建立三維復合體，即體外構建具有生物學功能的工程化組織。肝臟組織工程研究始終是組織工程研究的熱點領域之一，在近三十

3、年的發(fā)展過程中，已取得了諸多突破性進展。研究表明，體外再造肝臟具有一定的肝衰竭等肝臟疾病治療作用，系列核心技術在生物人工肝效能提升與更新?lián)Q代方面發(fā)揮了重要作用。盡管如此，由于肝臟結構與功能的復雜性，體外構建組織工程化肝臟器官仍面臨著一系列挑戰(zhàn)，如支架材料相容性差，且支架材料中缺乏類似于在體的脈管結構，導致再造肝臟體積受限;此外，現(xiàn)有的支架材料結構和組分相對單一，尚不能為肝細胞提供與體內環(huán)境類似的微環(huán)境。正因如此，近年來，基于脫細胞基質生

4、物材料的肝臟組織工程研究受到了越來越多的關注，發(fā)展異常迅速，并取得了一批階段性研究成果。
　　脫細胞基質是指利用化學法、物理法或酶解法來破壞組織/器官中的細胞結構，并將細胞碎片從細胞外基質(extracellular matrix，ECM)中清除而獲得的生物支架材料。利用不同洗脫條件處理后的脫細胞基質不僅可以保留組織或器官中的主要細胞外基質成分，而且可以使其中的血管系統(tǒng)及超微結構的完整性得到一定保存，因此是一種適應細胞生長和組織再

5、生的優(yōu)良材料。脫細胞技術的迅猛發(fā)展掀起了脫細胞基質的研究熱潮。自從2008年Ott等人首次成功制備出心臟全器官脫細胞基質以來，研究人員已成功獲得了多種臟器的全器官脫細胞基質，如肝臟、腎臟、肺臟等。肝臟作為機體最大的臟器，基于脫細胞基質支架材料的肝臟組織工程研究已成為組織工程研究領域的焦點之一。目前，用于肝臟組織工程研究的脫細胞基質支架材料主要包括兩類:非肝臟來源的脫細胞基質材料和肝臟來源的全器官脫細胞基質材料。
　　在基于非肝臟脫

6、細胞基質的肝臟組織工程研究方面，為了拓寬支架材料的來源，國內外研究人員致力于探索其他組織來源的非肝臟脫細胞基質材料應用于肝臟組織工程的可行性。例如，研究人員已成功利用空腸脫細胞基質材料構建了工程化類肝組織，研究發(fā)現(xiàn)空腸脫細胞基質材料能夠支持肝細胞正常的形態(tài)及其代謝活性，表明非肝臟來源的脫細胞基質材料能夠應用于肝臟組織工程研究。目前，研究其他組織來源的脫細胞基質材料對肝細胞的支持作用或構建工程化肝臟組織已為成本領域的研究熱點之一。

7、　　大網膜(greater omentum)是連接胃大彎至橫結腸的腹膜，富有極強的彈性和靈活性，同時具有高度血管化的結構，這些特點使其成為組織工程和再生醫(yī)學領域中優(yōu)良的天然材料。目前，大網膜在臨床上主要用于外科重建手術中對炎性或者缺損組織的修復，促進組織的再生;在組織工程研究領域，大網膜可作為體外移植構建物的“天然生物反應器”，促進構建物血管化的形成，增強移植構建物的功能，已成功應用于心肌組織工程、軟骨組織工程、神經組織工程等領域。近年

8、來，隨著脫細胞技術的迅猛發(fā)展，研究人員在大網膜脫細胞基質研究中開展了大量研究工作，并成功獲得了大網膜脫細胞基質支架材料，然而，目前尚未見將大網膜脫細胞基質應用于肝臟組織工程的研究報道。
　　在基于肝臟全器官脫細胞基質的肝臟組織工程研究方面，研究人員已經應用胎兒肝細胞、原代肝細胞、肝細胞系等多種來源的細胞接種到肝臟脫細胞基質中，成功在體外構建了具有一定功能的工程化肝臟組織或類器官。研究發(fā)現(xiàn)，與以往的支架材料相比，肝臟脫細胞基質能夠為

9、細胞提供更接近于天然肝臟的微環(huán)境。此外，由于細胞外基質成分在不同的物種之間具有高度保守性，脫細胞技術得到的細胞外基質支架同時具有低免疫原性的優(yōu)點，因而可以作為工程化肝臟組織構建中優(yōu)良的生物支架材料。
　　獲得結構及組成均優(yōu)良的肝臟脫細胞基質材料是開展基于脫細胞基質肝臟組織工程研究的基礎與前提。目前，肝臟脫細胞基質制備方法主要包括物理法、化學法、酶學消化法以及上述方法的組合使用等。然而，雖然脫細胞技術的發(fā)展日新月異，涌現(xiàn)了許多脫細胞

10、方法，但現(xiàn)有脫細胞洗脫方法均存在一定的不足，比如洗脫時間長、ECM成分破壞嚴重、生長因子大量丟失等。理想的制備肝臟全器官脫細胞基質的方法尚有待進一步優(yōu)化。
　　基于上述分析，本論文主要從以下三個方面開展研究工作:
　　第一部分:基于大網膜脫細胞基質支架材料的肝臟組織工程研究
　　目的:研究大網膜脫細胞基質支架材料的成分組成、生物相容性及其應用于肝臟組織工程的可行性。方法:利用免疫組織化學染色檢測四種大網膜脫細胞基質(N

11、o.1、2、3、4)的組成，通過掃描電鏡檢測其形態(tài)與孔徑大小;在此基礎上，分別接種大鼠原代分離的肝細胞構建工程化肝臟組織片層，并進行肝臟組織工程研究，不同時間點取材，通過Live/Dead染色檢測細胞活性，利用HE染色、免疫組織化學染色、酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測工程化組織中肝細胞形態(tài)及生物學功能。結果:四種大網膜脫細胞基質均含有天然ECM中主要蛋白組分并具有

12、典型的網狀結構，其中No.1、3基質孔徑較小，No.2、4基質孔徑較大;肝臟組織工程研究發(fā)現(xiàn)，與小孔徑支架材料相比，大孔徑大網膜脫細胞基質支架可以更好的支持肝細胞的粘附、生長及支持其糖原儲存、白蛋白分泌等生物學功能的發(fā)揮。結論:大網膜脫細胞基質作為一種優(yōu)良的生物支架材料，能夠維持肝細胞的形態(tài)并支持其生物學功能，在肝臟組織工程中具有良好的應用前景。
　　第二部分:肝臟全器官脫細胞支架材料的制備及條件優(yōu)化
　　目的:對兩種肝臟全

13、器官脫細胞基質制備方法進行比較，以期篩選出更為有效的肝臟脫細胞基質制備方法。方法:采用兩種不同方案(分別以十二烷基硫酸鈉(SDS)和TritonⅩ-100+SDS(Tx+SDS)為主要洗滌劑）制備肝臟全器官脫細胞基質，通過組織學、分子生物學等方法檢測基質中細胞和核酸成分的去除情況、ECM蛋白組成及生長因子含量。結果:兩種方法均能達到去細胞化要求;SDS方案得到的脫細胞基質脈管網絡遭到破壞，纖維網絡結構松散;Tx+SDS方案得到的脫細胞基

14、質脈管結構完整，ECM蛋白和生長因子含量均高于SDS方案。結論:利用Tx+SDS為主要洗滌的脫細胞方法可成功制備出優(yōu)良的肝臟全器官脫細胞基質，為工程化肝臟組織構建奠定了基礎。
　　第三部分:基于肝臟全器官脫細胞支架材料的肝臟組織工程研究
　　目的:探索以本研究中制備的肝臟全器官脫細胞基質為支架材料，構建工程化肝臟組織的可行性。方法:以Tx+SDS方案制備肝臟脫細胞基質，接種HepG2細胞系構建工程化肝組織片層，體外培養(yǎng)7天后

15、取材，利用HE染色、免疫組織化學染色、PAS染色研究工程化肝組織的形態(tài)及其生物學功能。結果:組織學染色結果表明，肝臟脫細胞基質支架可以支持細胞的粘附、生長，維持細胞形態(tài)和增殖能力;PAS染色結果顯示此支架材料能夠支持細胞糖原儲存生物學功能的發(fā)揮。結論:Tx+SDS方法制備的肝臟全器官脫細胞支架材料具有良好的生物相容性，可維持細胞形態(tài)并支持其生物學功能，能夠作為工程化肝臟組織構建的優(yōu)良支架材料。
　　綜上所述，本論文在基于非肝臟來源

16、脫細胞基質的肝臟組織工程研究方面，系統(tǒng)比較了四種具有大小兩類不同孔徑的大網膜脫細胞基質的成分組成，發(fā)現(xiàn)四種大網膜脫細胞基質均良好的保留有天然ECM主要蛋白成分且具有良好的生物相容性;與小孔徑支架材料相比，大孔徑大網膜脫細胞基質能夠更好的維持肝細胞形態(tài)并支持其糖原儲存、白蛋白分泌等生物學功能的發(fā)揮，證實了大網膜脫細胞基質應用于肝臟組織工程的可行性，拓展了肝臟組織工程中脫細胞基質支架材料的來源。在基于肝臟全器官脫細胞基質的肝臟組織工程研究方

17、面，本論文首先比較研究了兩種制備肝臟全器官脫細胞基質的洗脫方案，研究發(fā)現(xiàn)與SDS方案相比，Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細胞基質可以保留天然肝臟的三維網絡結構、脈管結構完整性，并能更好的保留ECM基本組分。其次，以Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細胞基質為支架材料構建工程化肝臟組織，發(fā)現(xiàn)工程化組織中細胞能夠維持良好的形態(tài)并能夠發(fā)揮生物學功能，表明以Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細胞基質具有良好的生物學性能，能夠作為工程化肝臟組織構建