轉(zhuǎn)人血清白蛋白延邊奶山羊-綿羊體細(xì)胞克隆胚胎生產(chǎn)體系的優(yōu)化.pdf

1、人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是迄今為止產(chǎn)量最大、用量最大的蛋白質(zhì)藥物。可是現(xiàn)在的生產(chǎn)方式主要是人的血液通過分級過濾獲得，產(chǎn)量有限，而且因?yàn)檠獫{來源復(fù)雜，容易導(dǎo)致污染。因此，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建乳腺表達(dá)載體，利用體細(xì)胞克隆技術(shù)得到分泌含人血清白蛋白乳汁的轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，并從動(dòng)物乳汁中提取人血清白蛋白，是解決人血清白蛋白供應(yīng)短缺的有效方法。乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人血清白蛋白具有生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品產(chǎn)量高、活性高、易于

2、純化等優(yōu)點(diǎn)。制約轉(zhuǎn)基因乳腺生物反應(yīng)制藥的主要因素是體細(xì)胞核移植技術(shù)效率低下。因此，本研究以延邊奶山羊和本地綿羊?yàn)檠芯繉ο螅瑢β涯讣?xì)胞體外成熟、延邊奶山羊-綿羊重構(gòu)胚胎的構(gòu)建及體外發(fā)育進(jìn)行了研究，以期提高核移植效率，為以后得到表達(dá)人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因延邊奶山羊奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　本研究共分為三個(gè)部分，第一部分進(jìn)行了不同核成熟抑制劑及抗氧化劑對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響的研究；第二部分進(jìn)行了轉(zhuǎn)人血清白蛋白延邊奶山羊-綿羊重構(gòu)胚的構(gòu)建

3、研究；第三部分是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epi-gallocatechin-3-gallate，EGCG）對轉(zhuǎn)人血清白蛋白延邊奶山羊-綿羊重構(gòu)胚體外發(fā)育質(zhì)量的影響。主要研究結(jié)果如下：
　　1.在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中，核成熟抑制劑HX、IBMX最適宜的添加濃度分別為2mM和0.2mM，抗氧化劑最佳添加量，除了半胱氨酸為0.6mM、EGCG為5μM之外，其余三種β-ME、VC、VE最佳添加量均為100μM；
　　2.

4、盲吸去核法或化學(xué)輔助去核法去核，重構(gòu)胚的卵裂率及囊胚率沒有顯著差異，但化學(xué)輔助去核法(0.2μg/mL的Deme處理0.5h)去核率為100％，可以高效快速地去核，且不影響重構(gòu)胚的早期發(fā)育；
　　3.延邊奶山羊-綿羊重構(gòu)胚的適宜電融合參數(shù)為2個(gè)120V，40μs次的電脈沖，適宜激活方法為Ion預(yù)激活5分鐘，6-DMAP激活2h；
　　4.重構(gòu)胚體外培養(yǎng)時(shí)EGCG的適宜添加濃度為15μM，適宜添加時(shí)間為IVM和重構(gòu)胚體外培養(yǎng)1