轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因奶山羊安全性評(píng)價(jià).pdf

1、近些年，轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)生了迅猛的發(fā)展，為了快速提高經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能，科學(xué)家們制備了越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過(guò)轉(zhuǎn)入外源基因改變生產(chǎn)性能的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是否會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成威脅，這一問(wèn)題在科學(xué)界和社會(huì)上一直存在這比較大的爭(zhēng)議。因此，全方位多角度的對(duì)未上市的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，對(duì)人類社會(huì)的和諧發(fā)展以及生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的意義。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功的制備了提高奶產(chǎn)量的轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素(growth hor

2、mone， GH)基因奶山羊。本試驗(yàn)以轉(zhuǎn)GH基因奶山羊?yàn)檠芯磕繕?biāo)，從自身安全、環(huán)境安全和食品安全角度來(lái)評(píng)價(jià)其安全性。首先，通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)比較泌乳期的轉(zhuǎn)GH基因奶山羊和非轉(zhuǎn)基因奶山羊乳腺的基因表達(dá)水平，來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的自身安全性;然后，采集轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的糞便和腸道內(nèi)容物以及轉(zhuǎn)基因羊場(chǎng)內(nèi)環(huán)境土壤為樣本，檢測(cè)樣品中樣品基因組中外源基因GH和neo的漂移情況，進(jìn)而通過(guò)PCR-DGGE方法分析樣品中菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)行轉(zhuǎn)GH基因奶

3、山羊的環(huán)境安全性評(píng)價(jià);最后，通過(guò)飼喂SD大鼠來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)GH基因羊奶的食品安全性，主要檢測(cè)了轉(zhuǎn)GH基因羊奶對(duì)SD大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫水平以及行為狀態(tài)的影響。主要試驗(yàn)分為以下四個(gè)階段:
　　1轉(zhuǎn)GH基因奶山羊泌乳期乳腺基因表達(dá)水平的變化
　　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性評(píng)價(jià)體系中，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自身安全的評(píng)價(jià)是重要的一環(huán)，這關(guān)系到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備成功與否的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)GH基因奶山羊轉(zhuǎn)入的是乳腺特異性表達(dá)的山羊生長(zhǎng)激素基因，因此轉(zhuǎn)基因山羊乳腺發(fā)育的變

4、化是否會(huì)對(duì)動(dòng)物體的健康造成隱患，需要進(jìn)一步的研究。本試驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，比較轉(zhuǎn)GH基因奶山羊泌乳期乳腺組織基因水平與非轉(zhuǎn)基因奶山羊的差別。并選擇15個(gè)與生長(zhǎng)激素影響乳腺發(fā)育相關(guān)的基因，通過(guò)qRT-PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)GH基因奶山羊乳腺中過(guò)表達(dá)的生長(zhǎng)激素雖然能夠促進(jìn)乳腺細(xì)胞的過(guò)量增殖，但是動(dòng)物機(jī)體通過(guò)自身的調(diào)節(jié)可以將乳腺的增殖保持在健康水平，證明了轉(zhuǎn)GH基因奶山羊能夠健康的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　2轉(zhuǎn)GH基因奶山羊外源基因

5、漂移檢測(cè)
　　在評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物安全性的過(guò)程中，環(huán)境安全性評(píng)價(jià)是必不可少的一環(huán)，而外源基因漂移的檢測(cè)又是環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的重中之重。本部分試驗(yàn)的研究目的是通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的腸道內(nèi)容物、糞便和環(huán)境土壤中細(xì)菌基因組進(jìn)行檢測(cè)，以確定是否發(fā)生基因漂移事件。首先，分別采集轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素奶山羊和非轉(zhuǎn)基因奶山羊的腸道內(nèi)容物和糞便以及羊場(chǎng)內(nèi)部和附近的土壤作為樣品，然后利用商業(yè)化的基因組提取試劑盒提取樣品中存在的細(xì)菌基因組，在針對(duì)制備轉(zhuǎn)

6、GH基因奶山羊的載體設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，最后通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證樣品基因組中是否存在外源基因。檢測(cè)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的腸道內(nèi)容物樣品、糞便樣品以及環(huán)境土壤樣品中的細(xì)菌基因組均未檢測(cè)到外源的山羊生長(zhǎng)激素基因以及neo基因。這些結(jié)果證明了，轉(zhuǎn)GH基因奶山羊外源基因整合狀態(tài)穩(wěn)定，沒(méi)有發(fā)生基因漂移事件。
　　3轉(zhuǎn)GH基因奶山羊?qū)Νh(huán)境菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在養(yǎng)殖生產(chǎn)階段是否會(huì)對(duì)周圍環(huán)境物種造成影響一直是社會(huì)和科學(xué)界關(guān)注的

7、焦點(diǎn)，而評(píng)價(jià)周圍環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。本研究的目的是評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)GH基因奶山羊?qū)χ車h(huán)境菌群結(jié)構(gòu)的影響。首先通過(guò)PCR擴(kuò)增方法得到轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的糞便、腸道內(nèi)容物和環(huán)境土壤樣品中細(xì)菌基因組的16srDNA基因V3區(qū)域片段;然后通過(guò)PCR-DGGE方法將不同序列的DNA片段分離，并將分離出來(lái)的條帶進(jìn)行回收純化;最后將回收的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，并提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，得到細(xì)菌種屬信息。PCR-

8、DGGE電泳相似性數(shù)據(jù)分析表明，各類樣品的相似度在95％以上;各樣品的菌群種屬統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，各樣品的優(yōu)勢(shì)菌群相同，整體菌群機(jī)構(gòu)分布趨勢(shì)一致。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的存在，對(duì)其生存空間存在的微生物菌群結(jié)構(gòu)并沒(méi)有造成顯著性的差異。從環(huán)境安全性方面考慮，轉(zhuǎn)GH基因奶山羊并沒(méi)有展現(xiàn)出破壞環(huán)境中生物多樣性的特性。
　　4轉(zhuǎn)GH基因羊奶食品安全性評(píng)價(jià)
　　在評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物安全性時(shí)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的食品同樣要進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。因此，

9、本試驗(yàn)通過(guò)飼喂動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)GH基因奶山羊產(chǎn)出的羊奶的食品安全性。本試驗(yàn)將60只大鼠分成三組，分別飼喂轉(zhuǎn)GH基因羊奶、正常羊奶以及生理鹽水，飼喂周期為90天。飼喂期間每天觀察記錄大鼠的生活習(xí)性，并定期稱量體重;采集各組大鼠的血液樣品進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)和血清生化檢測(cè);用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中免疫相關(guān)指標(biāo)IL-2、IgG、IgE和IFN-γ的水平;90天后對(duì)大鼠進(jìn)行剖檢，對(duì)主要臟器進(jìn)行稱重以及組織病理切片觀察。各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)GH基因