PCR技術(shù)檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的研究.pdf

1、阪崎腸桿菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、菌血癥、小腸結(jié)腸炎，并可能引起神經(jīng)功能紊亂，造成嚴重的后遺癥，死亡率高達20％～50％以上，引起世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。通過研究發(fā)現(xiàn)嬰兒配方奶粉是其主要的感染源。傳統(tǒng)方法操作繁瑣，檢測時間長，且靈敏度較低。本研究利用FTA濾膜與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法建立了一套從嬰兒配方奶粉中快速檢出阪崎腸桿菌的方法，縮短了阪崎腸桿菌的檢測時間，提高了靈敏度。 本研究以阪崎腸桿菌的16S rRNA基因為靶基因，選

2、擇特異性引物，進行PCR擴增，檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌。對PCR反應(yīng)體系中鎂離子濃度、引物添加量及退火溫度和循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化，以確定適宜的PCR反應(yīng)體系和擴增程序，其適宜反應(yīng)體系為:6μL10×PCR buffer，4μL dNTPs混合物，2.5Mg2+μL(25mM)，2μL10 μmol正向引物，2μL 10μmol反向引物，0.25μL(5U/μL)Taq，23.25μL水，總反應(yīng)體系為50μL；其適宜的PCR擴增程序為:PC

3、R反應(yīng)采用冷啟動，95℃預(yù)變性5 min；變性95℃1min～退火61℃0.5min進行35個循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。對擴增產(chǎn)物進行了測序，PCR擴增產(chǎn)物序列與文獻報道的靶基因序列的同源性達100％，從而證實PCR擴增產(chǎn)物確為目的擴增產(chǎn)物。本研究共檢測了16株菌，以驗證引物的特異性，結(jié)果表明:4株阪崎腸桿菌均為陽性結(jié)果；12株其它菌株均為陰性結(jié)果。因此該引物特異性強，可用于檢測阪崎腸桿菌。

4、 采用FTA濾膜制備模板進行PCR擴增，其方法的靈敏度為7×101 cfu/mL。 采用FTA濾膜制備模板，利用PCR技術(shù)檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌，以確定檢出限。結(jié)果表明，經(jīng)過4h增菌后嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢出限為7×100cfu/100g?？稍?h內(nèi)完成對嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢測，比目前普遍采用的傳統(tǒng)檢測的方法縮短了12～22h。 比較了檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的6種模板制備方法，結(jié)果表明F

5、TA濾膜法可高效從樣品中提取阪崎腸桿菌DNA，可有效的消除PCR反應(yīng)的抑制因子，靈敏度高、操作簡便、耗時短，該方法明顯優(yōu)于其他方法。 對實際樣品進行檢測，將本方法與行業(yè)標準SN/T 1632.1-2005方法進行比較，確定本方法敏感性為100％，特異性為98.2％符合率為98.2％。 本研究方法使用FTA濾膜法制備模板DNA，可高效的提取樣品中的DNA，有效的消除PCR反應(yīng)抑制因子，操作簡便，為PCR快速檢測食品中的致病