檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌抑菌和抗感染作用及其分子機(jī)制.pdf

1、阪崎克羅諾腸桿菌(Cronobacter sakazakii)是一種周生鞭毛、棒狀、兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，能夠引起新生兒腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和菌血癥等疾病，致死率高達(dá)50-80％，有效預(yù)防和控制阪崎克羅諾腸桿菌對于保障嬰幼兒健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，尋求一種安全高效的嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌控制技術(shù)方法成為全球研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn);阪崎克羅諾腸桿菌污染范圍廣，嬰幼兒配方奶粉是其疫情爆發(fā)的主要食物來源，為有效抑制乳粉及其他食品

2、中的阪崎克羅諾腸桿菌，紅外、UV輻照及電子束照射等多種技術(shù)已被探討，然而，當(dāng)前能夠控制阪崎克羅諾腸桿菌的方法嚴(yán)重?fù)p害乳粉的感官及營養(yǎng)品質(zhì)，不被消費(fèi)者廣泛接受，因此，探索有效、安全、經(jīng)濟(jì)而又不易導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)降低的控制方法及抗感染分子機(jī)制，對預(yù)防嬰幼兒乳粉中阪崎克羅諾腸桿菌的危害具有重要理論價值與重大產(chǎn)業(yè)應(yīng)用潛力;研究發(fā)現(xiàn)植物源的某些活性物質(zhì)在一定濃度下能通過抑制細(xì)菌的毒力因子達(dá)到抗感染的功效，然而植物源活性物質(zhì)對阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用

3、及抗感染分子機(jī)制研究少且缺乏深度，難以支撐產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。因此，本研究在篩查、甄選對阪崎克羅諾腸桿菌有強(qiáng)抑制能力的植物源活性物質(zhì)檸檬醛的基礎(chǔ)上，分別從抑制菌體生長—抑制毒力因子—保護(hù)宿主機(jī)體三個角度進(jìn)行了系統(tǒng)研究，重點(diǎn)揭示了檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用機(jī)制，對毒力因子、生物膜形成能力及抗群體感應(yīng)的分子機(jī)制，對阪崎誘導(dǎo)的腸細(xì)胞炎癥反應(yīng)及動物模型的保護(hù)作用，并探究了檸檬醛與溫和加熱結(jié)合對復(fù)原嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌的抑殺作用，具體研究

4、內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.植物源活性物質(zhì)對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌活性評價
　　系統(tǒng)篩查、甄別了50種植物源化合物對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌作用，獲得了50種植物源化合物對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌圈及最小抑菌濃度(Minimum InhibitoryConcentration，MIC)，優(yōu)選獲得了植物源高效抑菌劑。試驗(yàn)首先通過牛津杯法，測定了50種植物源活性物質(zhì)對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌圈直徑;隨后利用瓊脂稀釋法，測定了產(chǎn)生抑菌圈的

5、物質(zhì)對ATCC29544的MIC;最后，篩選對ATCC29544的MIC≤5 mg/mL的物質(zhì)，測定其對4株ATCC標(biāo)準(zhǔn)及5株食品來源分離阪崎克羅諾腸桿菌菌株的MIC。結(jié)果表明:40種物質(zhì)對阪崎克羅諾腸桿菌有可見的抑菌圈，其中7種物質(zhì)（香芹酚、百里醌、百里酚、肉桂醛、檸檬醛、原兒茶醛和原兒茶酸）的抑菌圈平均直徑≥13 mm;40種產(chǎn)生抑菌圈的植物源活性物質(zhì)中，18種物質(zhì)對ATCC29544的MIC≤5 mg/mL。在本研究選取的50種植

6、物源物質(zhì)中，百里酚和香芹酚對阪崎克羅諾腸桿菌有著最強(qiáng)的抑制作用，對9株阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌濃度均為0.1-0.2 mg/mL之間;百里醌、肉桂醛、檸檬醛和原兒茶醛對阪崎克羅諾腸桿菌有良好的抑菌效果，其三者對阪崎克羅諾腸桿菌的MIC為0.3-1.25 mg/mL;阿魏酸、綠原酸、丁香酸、硫辛酸、原兒茶酸、表兒茶素、咖啡酸、丹皮酚和菊苣酸的MIC為2.5-5 mg/mL。本章篩選的植物源活性物質(zhì)檸檬醛為后續(xù)的抑制及抗感染分子機(jī)制研究奠定了

7、基礎(chǔ)。
　　2.檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的抑制作用機(jī)制的研究
　　通過瓊脂稀釋法檢測檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度并通過液體稀釋法測定阪崎克羅諾腸桿菌的生長曲線，應(yīng)用修正Gompertz數(shù)學(xué)模型擬合其生長曲線并表征生長參數(shù)。利用多種熒光探針檢測檸檬醛對細(xì)菌細(xì)胞膜完整性、胞內(nèi)pH、胞內(nèi)ATP濃度、膜電位的作用，并借助激光共聚焦顯微鏡及場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測檸檬醛對細(xì)菌細(xì)胞膜完整性及細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果表明:檸檬醛對阪

8、崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度為0.27-0.54 mg/mL，并可顯著延長阪崎克羅諾腸桿菌的生長延滯期，降低最大生長速率及最大菌體密度;兩種檢測濃度的檸檬醛（MIC和2MIC）使細(xì)菌胞內(nèi)pH由6.06降低為5.01和4.84，使細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度由0.416μmol/L降低為0.078及0.056μmol/L，使細(xì)菌細(xì)胞膜完整性分別降低56％和85％，并且使細(xì)菌細(xì)胞膜電位出現(xiàn)超級化。電鏡結(jié)果表明檸檬醛使阪崎克羅諾腸桿菌細(xì)胞膜完整性顯著降

9、低，并改變了菌體形態(tài)，使菌體干癟、皺縮。這些結(jié)果說明檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的抑菌作用可能是通過改變細(xì)胞膜的通透性及細(xì)胞形態(tài)來完成的。
　　3.檸檬醛結(jié)合溫和加熱對復(fù)原嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌的抑殺作用
　　構(gòu)建污染復(fù)原嬰幼兒牛乳模型，探究檸檬醛與溫和加熱結(jié)合對復(fù)原嬰幼兒牛乳中干燥及非干燥阪崎克羅諾腸桿菌的抑殺作用。將3種阪崎克羅諾腸桿菌的混合菌株（濃度約6.0 log CFU/mL）接種于含有不同濃度檸檬醛（0、0.3

10、％、0.6％和0.9％）的復(fù)原嬰幼兒牛乳樣品中，將分別樣品置于25℃、45℃、50℃和55℃培養(yǎng)，并在不同的時間點(diǎn)對樣品中存活的阪崎克羅諾腸桿菌涂布計數(shù)。結(jié)果表明:檸檬醛與溫和加熱結(jié)合具有良好的抑菌效果，并且干燥菌體比非干燥菌體對結(jié)合作用更加敏感。以上結(jié)果說明檸檬醛與溫和加熱協(xié)同作用方法有潛力在嬰幼兒乳粉復(fù)原過程中使用。
　　4.檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌毒力因子的抑制作用機(jī)制
　　探究亞致死濃度的檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌毒力

11、因子的抑制作用。利用含有不同濃度瓊脂的半固體培養(yǎng)基，觀測檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌泳動及群集運(yùn)動的影響;借助透射電子顯微鏡觀測檸檬醛對鞭毛形成的影響;通過檢測檸檬醛處理后的阪崎克羅諾腸桿菌對人克隆結(jié)腸癌腺細(xì)胞Caco-2粘附及侵入菌量以及在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的存活和增殖菌量，探究檸檬醛對降低阪崎克羅諾腸桿菌對宿主侵襲力的作用;利用內(nèi)毒素檢測試劑盒探究檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌內(nèi)毒素產(chǎn)量的影響;通過RT-PCR檢測檸檬醛對15個毒

12、力基因的表達(dá)影響。結(jié)果表明:225μM濃度以下的檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌的生長沒有影響，試驗(yàn)選取225μM、112.5μM和56.25μM作為后續(xù)探究致病性抑制作用的濃度;亞致死濃度的檸檬醛能夠顯著降低阪崎克羅諾腸桿菌在半固體培養(yǎng)基上的泳動及群集運(yùn)動，并使其鞭毛生成量明顯減少;檸檬醛能夠降低阪崎克羅諾腸桿菌對Caco-2細(xì)胞的粘附及侵入的菌量，并可降低其在巨噬細(xì)胞RAW264.7中的存活及增殖的能力;檸檬醛使其內(nèi)毒素產(chǎn)量顯著降低，并使1

13、5個毒力相關(guān)基因表達(dá)量顯著下降。這些結(jié)果表明，檸檬醛有潛力作為替代品或補(bǔ)充劑減緩由阪崎克羅諾腸桿菌引起的感染。
　　5.檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌生物膜及群體感應(yīng)抑制作用分子機(jī)制
　　分別以不銹鋼、玻璃、硅膠三種嬰幼兒奶瓶常用的材料為生物膜形成的表面，以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(TSB)和復(fù)原嬰幼兒配方奶粉(IFB)為培養(yǎng)介質(zhì)，以12℃、25℃和37℃為生長溫度，對阪崎腸桿菌生物膜的形成能力進(jìn)行系統(tǒng)研究?；谏锬ば纬赡芰跋緞┣宄芰?，

14、重點(diǎn)分析檸檬醛對阪崎克羅諾腸桿菌生物膜形成的作用及AHL群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明:阪崎克羅諾腸桿菌對非生物表面的粘附和生物膜的形成受生長溫度，培養(yǎng)基質(zhì)的影響，12℃阪崎腸桿菌粘附和生物膜形成能力最弱，25℃和37℃生物膜形成周期快，其在TSB中生物膜形成能力強(qiáng)于其在IFB中的能力;阪崎克羅諾腸桿菌生物膜對消毒劑的抗性受培養(yǎng)時間和表面類型的影響;檸檬醛能夠抑制阪崎克羅諾腸桿菌在12℃和25℃生物膜的形成能力并顯著抑制紫色桿菌ATCC1

15、2472的群體效應(yīng)信號系統(tǒng);檸檬醛下調(diào)了編碼纖維素合成基因（bcsA和bcsG）和群體效應(yīng)信號系統(tǒng)相關(guān)基因（luxR）的表達(dá)。這些結(jié)果表明，檸檬醛有潛力作為生物膜及群體感應(yīng)抑制劑應(yīng)用于食品工業(yè)中。
　　6.檸檬醛有效減弱阪崎克羅諾腸桿菌引起的腸道炎癥反應(yīng)分子機(jī)制
　　通過構(gòu)建阪崎克羅諾腸桿菌侵染人小腸上皮細(xì)胞Caco-2炎癥模型與昆明新生小鼠腸道炎癥模型，從細(xì)胞及動物模型探究檸檬醛有效減弱阪崎腸桿菌引起的腸道炎癥反應(yīng)而達(dá)到保

16、護(hù)宿主細(xì)胞的分子機(jī)制。研究從阪崎克羅諾腸桿菌對腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、LDH的釋放、NO產(chǎn)生、炎癥因子TNF-α的釋放、Caspase-3酶活等來揭示檸檬醛的抗炎機(jī)理。結(jié)果表明10μg/mL的檸檬醛對人腸上皮細(xì)胞Caco-2不產(chǎn)生毒性且不影響增殖。在安全濃度范圍處理Caco-2細(xì)胞，檸檬醛顯著降低了細(xì)胞的凋亡程度、NO的產(chǎn)生，并降低炎癥因子TNF-α的釋放及Caspase-3的酶活力從而減弱炎癥反應(yīng)。動物試驗(yàn)結(jié)果表明:檸檬醛能保護(hù)昆明新生