阪崎克羅諾桿菌菌膜形成相關(guān)基因的篩選鑒定.pdf

1、阪崎克羅諾桿菌能引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、菌血癥、小腸結(jié)腸炎，并可能引起神經(jīng)功能紊亂，造成嚴(yán)重的后遺癥，死亡率高達(dá)20％-50％，引起世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。通過研究發(fā)現(xiàn)嬰兒配方奶粉是其主要的感染源。菌膜形成是細(xì)菌對抗不利環(huán)境的一種自我保護(hù)機(jī)制。在形成菌膜后，菌體對外界各種理化因子的耐受力會大大增加。在阪崎克羅諾桿菌的菌膜形成中，纖維素合成的相關(guān)基因、鞭毛的形成和功能基因均起到了非常重要的作用。然而，目前關(guān)于阪崎克羅諾桿菌的菌膜形成機(jī)制仍然

2、不清楚。
　　本研究首先利用結(jié)晶紫染色法，對23株食源性阪崎克羅諾桿菌菌膜形成能力進(jìn)行檢測，從中篩選出1株菌膜形成能力最強(qiáng)的菌株。再利用電轉(zhuǎn)化法，將EZ-TN5轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入到這株阪崎克羅諾桿菌中，構(gòu)建了轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫，共獲得430株突變株。隨后利用結(jié)晶紫法對430株突變株的菌膜形成能力進(jìn)行檢測，篩選出菌膜形成能力較野生型菌株均降低40％以上的突變株12株。利用IPCR(反向PCR)和Tail-PCR（交錯式熱不對稱PCR）的方法對

3、這12株突變株中EZ-TN5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，最終成功測序出8個(gè)目的基因序列，BLAST同源性比對結(jié)果顯示這8個(gè)基因可能編碼的蛋白分別為:hypotheticalproteinCTU_14280、aldehydereductase、phosphopentomutase、lipoproteinNlpD、argininosuccinatesynthase、phagetailproteinR(GpR)和excinuclease

4、ABCsubunitA。利用Southern雜交的方法證實(shí)了這8個(gè)突變株基因組DNA中均只含有一個(gè)轉(zhuǎn)座子序列，從而證明這些基因與菌膜形成的相關(guān)性。通過對阪崎克羅諾桿菌野生型和菌膜突變株生長曲線的對比分析可知，突變后的菌株生長速率并未明顯改變，證明菌膜形成降低并不是由于菌體生長受到抑制造成的。利用掃描電鏡對野生株和突變株形成的菌毛進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示野生型可以形成較厚的菌膜，而突變株只能形成一層較弱的胞外聚合物，進(jìn)一步證實(shí)了這些基因與菌膜形