五重PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆及其食用油脂的研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品商品化，轉(zhuǎn)基因植物、動(dòng)物、微生物加工而成的轉(zhuǎn)基因食品在傳統(tǒng)食品市場(chǎng)中的份額在不斷加大，轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)不知不覺(jué)的走進(jìn)了人們的餐桌，進(jìn)入了食物鏈。然而，轉(zhuǎn)基因食品中含有新的遺傳物質(zhì)，即外源DNA以及由外源基因編碼的新蛋白，而傳統(tǒng)食品是不存在這些情況的，并且傳統(tǒng)食品是經(jīng)過(guò)人類(lèi)幾千年的食用證明是安全的，因此轉(zhuǎn)基因食品的安全性是擺在人類(lèi)面前的重大難題；由于轉(zhuǎn)基因食品的安全性在較短的時(shí)間內(nèi)無(wú)法確定，因此，目前各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品都采用標(biāo)簽

2、制度進(jìn)行管理，所以急需建立一套能夠?qū)D(zhuǎn)基因食品進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測(cè)的方法。 根據(jù)已經(jīng)商品化的轉(zhuǎn)基因大豆種類(lèi)，確定了以35S啟動(dòng)子(Cauliflowermosaicvirus 35S，CaMV3 5S)、Nos終止子(Nopalinesynthase,Nos)、NPT Ⅱ、CP4-EPSPS四種外源基因和大豆內(nèi)源基因(Lectin)為檢測(cè)的目的片段，建立了五重PCR反應(yīng)體系，并采用改進(jìn)的方法提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了四個(gè)外

3、源基因的特異性同步檢測(cè)，檢測(cè)了已知轉(zhuǎn)基因大豆、市售大豆和轉(zhuǎn)基因食用油脂，確定了檢出限為0.1％。 五重PCR反應(yīng)體系最終確定為：總反應(yīng)體系為58.5μL。其中包括0.5μL(5U/μL)Taq，5μL 10×PCR buffer，4μL dNTPs混合物，6μL Mg<'2+>，Lectin正向和反向引物各為2μL，CaMV正向和反向引物各為1.9μL，NPTⅡ正向和反向引物各為1.91μL，CP4．EPSPS正向和反向引物各為

4、2μL，NOS正向和反向引物各為1.7μL，模版4μL，ddH<,2>O 20μL。五重PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，在按94℃40s → 57℃30s → 72℃30s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了DNA測(cè)序，CaMV35S、NOS、NPTⅡ、CP4-EPSPS、Lectin的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的靶基因序列