一種多重PCR技術在轉基因大豆檢測中的應用研究.pdf

1、目的:本課題利用公共引物介導的多重PCR技術(Universal primer-multiplexpolymerase chain reaction，UP-MPCR)，以我國批準進口（已經頒發(fā)了安全證書）的12種轉基因大豆中轉基因序列為基因檢測靶標，建立一種低成本、高特異性和高效的多重PCR方法體系，研發(fā)適用于加工食品中轉基因大豆成分鑒定的核酸檢測試劑盒。
　　方法:本課題包括設計引物、構建質粒模板、建立多重檢測體系、多重體系檢測

2、。本課題中設計引物包括公共引物、特異引物和嵌合引物。公共引物設計原則:長度17～20bp、GC％含量合適、無重復序列、引物間無二聚體和發(fā)卡結構等，經過Blast比對修改后，要求與以轉基因大豆和非轉基因大豆基因組DNA為模板擴增無特異性產物，再以轉基因大豆和非轉基因大豆基因組DNA為模板進行PCR實驗驗證，篩選公共引物。將篩選出的3條公共引物通過PCR連接到一段大豆Lectin基因序列兩端，插入質粒載體中構建重組質粒，經過測序驗證后，將陽

3、性重組質粒梯度稀釋作為模板，用公共引物進行擴增，檢測各公共引物擴增的敏感性。
　　通過文獻、數(shù)據(jù)庫和專利等搜索獲得這12種轉基因大豆(MON87701、GTS40-3-2、MON89788、CV127、A2704、A5547、DP356043、DP305423、MON87769、MON87708、305423×40-3-2、MON87701×MON89788，其中有兩種為復合性狀轉基因大豆）插入序列和5'、3'側翼序列，采用品系特

4、異性檢測方法，在轉基因大豆插入序列與大豆基因組的5'或3'側翼連接區(qū)域設計引物，比對引物，同時進行多重引物比對。將篩選出的公共引物連接在特異引物的5'端構成嵌合引物，將多對嵌合引物通過以上同樣的方法進行比對獲得最佳嵌合引物，通過PCR實驗驗證其特異性及敏感性。本課題目的是構建一個同時檢測12種轉基因大豆的多重檢測體系，本體系的建立包括單對嵌合引物的特異性檢測、確定擴增體系和反應條件、多重檢測體系的特異性和敏感性檢測。本體系采用兩步溫度法

5、，前10個循環(huán)采用高退火溫度(61℃)，后30個循環(huán)采用低退火溫度(54℃)。將10種轉基因大豆的部分靶序列和部分大豆Lectin序列，通過不同的分子克隆方法構建了4個重組質粒陽性模板，包括含有4個目的片段的pSOYG1、含有5條目的片段的pSOYG2和2個只含有1條目的片段的重組質粒模板。
　　結果:本課題成功設計并成功篩選出了3條公共引物，與轉基因大豆和非轉基因大豆基因組DNA擴增無影響結果判斷的特異性產物，且公共引物敏感性達

6、到100個拷貝。
　　本課題針對12種轉基因大豆和大豆內參基因Lectin構建了2個分別含有4個或5個目的片段的陽性重組質粒模板pSOYG1和pSOYG2、2個只含有單個插入片段的陽性質粒模板。其中pSOYG1含有4條目的片段，4條目的片段分別對應轉基因大豆MON87701、GTS40-3-2、MON89788和內參基因Lectin; pSOYG2含有5條目的片段，5條目的片段分別對應轉基因大豆A2704-12、DP356043、

7、DP305423、CV-127、A5547-127;2個只含有單個插入片段的陽性質粒模板，分別對應轉基因大豆MON87708、 MON87769。
　　本課題構建了用于12種轉基因大豆核酸檢測的公共引物介導的多重PCR檢測體系(UP-MPCR)，采用了品系特異性檢測方法，具有高特異性和高敏感性。本體系敏感性達到了0.1ng，即0.1％(0.1ng/100 ng樣品DNA)。
　　結論:本課題構建的公共引物介導的多重PCR(U