LAMP法在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應用研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學2009級碩士學位論文LAMP法在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應用研究ThestudyonthedetectionofgeneticallymodifiedinfoodsusingLoop—mediatedisothermalamplification課題來源：國家公益性行業(yè)科研專項(200910265)專業(yè)名稱學位申請人指導教師答辯委員會主席答辯委員會成員生物化學與分子生物周琳華馬文麗教授均又聃教搜龐義教授黃樹林教授曹以誠教授程遠雄

2、教授符立梧教授論文評閱人高國全教授胡志奇教授2012年5月15日廣州摘要擴增多態(tài)性DNA技術(RandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD技術)、擴增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP技術)、簡單重復序列又稱微衛(wèi)星DNA技術(SimpleSequenceRepeat，SSR技術)，和簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性分子標記(InterSimpleSequen

3、ceRepeats，ISSR)等。環(huán)介導等溫擴增技術(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)是由Notomi等所屬的日本榮研株式會社于2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該技術的基本原理是針對待測基因靶序列的6個特異性區(qū)域設計兩對引物(分別稱為上游內(nèi)部引物FIP、下游內(nèi)部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNApolymera

4、se)在恒溫條件(65℃左右)保溫3060分鐘，即可實現(xiàn)核酸的大量擴增。其特點是操作簡單、快速、特異性高、成本低廉，故被廣大研究者認為是可能替代PCR的新的核酸擴增技術。本研究采用LAMP檢測技術，針對轉(zhuǎn)基因大豆GTS4032、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米BTl76和轉(zhuǎn)基因水稻TT511四個品系的外源插入基因、內(nèi)源參照基因、品系特異性基因進行相關實驗研究。研究內(nèi)容主要分為三個部分：第一部分：查找相關文獻資料，以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40

5、32的外源插入基因CP4EPSPS為研究對象，摸索LAMP檢測技術反應體系與相關參數(shù)。通過一系列實驗，得出結(jié)論為：在25皿反應體系中，1mmol／L甜菜堿，20mmol／LM礦5、081tL(即8U)BstDNA聚合酶、08mmol／LdNTPs、內(nèi)外引物濃度比為1／8加入去離子滅菌水補足體系，65。C恒溫度60min，LAMP反應體系比較穩(wěn)定，擴增產(chǎn)物條帶清晰。第二部分：針對轉(zhuǎn)基因大豆GTS4032、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因玉米