轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品檢測(cè)方法的研究.pdf

1、該研究比較了改良CTAB法、試劑盒法以及SDS法提取大豆、玉米、油菜等七種植物產(chǎn)品總DNA的產(chǎn)量、純度和效率.三種方法中,改良CTAB法提取植物總DNA的產(chǎn)量和純度最高,且成本較低,經(jīng)濟(jì)實(shí)用;試劑盒法次之,雖其提取效率較高,但價(jià)格昂貴;SDS法提取的總DNA提取液中因含有較多的PCR擴(kuò)增抑制物,因此不適于作為PCR擴(kuò)增模板.通過紫外吸收、瓊脂糖凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)比較得出,改良CTAB法和試劑盒法純化所得到的DNA純度均適用于PCR擴(kuò)增等下游

2、檢測(cè).在植物總DNA提取液產(chǎn)量和純度均達(dá)到下游檢測(cè)要求的基礎(chǔ)上,對(duì)植物產(chǎn)品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分定性和定量檢測(cè).通過DNAMAN PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了針對(duì)大豆、玉米等轉(zhuǎn)基因植物中CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、FMV35S啟動(dòng)子等特異性引物,對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,以上述優(yōu)化的體系對(duì)七種植物產(chǎn)品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的初步篩選;在此基礎(chǔ)上,根據(jù)不同植物產(chǎn)品中所轉(zhuǎn)入的外源目標(biāo)基因,通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行品系檢測(cè)和鑒定.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖

3、凝膠電泳,結(jié)果表明:可得到預(yù)期大小的DNA片段,經(jīng)過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、克隆、測(cè)序,對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,可得到預(yù)期的測(cè)序結(jié)果.在定性檢測(cè)的基礎(chǔ)上,對(duì)陽性轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè).根據(jù)轉(zhuǎn)入的外源基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman探針,通過在線分析基因起始拷貝數(shù)的方式,以不同含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)定起始DNA的數(shù)量,通過內(nèi)源基因Lectin校正系統(tǒng)檢測(cè)誤差,計(jì)算轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的含