高羊茅FaChit1基因的克隆與表達(dá)調(diào)控以及一種轉(zhuǎn)基因植物新型檢測(cè)方法的研究.pdf

1、高羊茅是一種分布十分廣泛的草坪草，主要用于草坪的建植，人們居住環(huán)境的美化。由于草坪草抗逆性較差，在生長(zhǎng)過(guò)程中容易受致病性真菌等多種病原體的侵染。如何提高它們的抗病、抗蟲(chóng)、抗旱、耐鹽以及耐瘠薄特性已成為一個(gè)重要的研究方向，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將植物幾丁質(zhì)酶基因等抗性基因?qū)氩萜翰莼蚪M不失為一種有效的手段。植物幾丁質(zhì)酶能夠通過(guò)水解真菌和昆蟲(chóng)圍咽膜的幾丁質(zhì)組分，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有效提高植物對(duì)病蟲(chóng)害的抗性；而且有些植物幾丁質(zhì)酶還具有其它抗逆功能，可以

2、增強(qiáng)植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力。但目前可利用的這類有利基因較少，且涉及基因?qū)＠蜕锇踩栽u(píng)價(jià)問(wèn)題。通過(guò)對(duì)草坪草品種抗逆性狀的調(diào)研鑒定，發(fā)現(xiàn)高羊茅(Festuca arundinacea)具有抗病性強(qiáng)、抗旱、耐瘠薄、適應(yīng)性廣等優(yōu)良性狀，若能從高羊茅分離出Ⅰ類幾丁質(zhì)酶基因及其啟動(dòng)子序列并進(jìn)行功能驗(yàn)定，然后運(yùn)用基因工程方法將二者一起轉(zhuǎn)入其它需要改良的的草坪草中，則相關(guān)草坪草的抗病及抗逆性狀問(wèn)題不但有望得到一定程度的解決，而且外源轉(zhuǎn)移基因能在其自身

3、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行有選擇的誘導(dǎo)表達(dá)，與一般采用組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化體相比，轉(zhuǎn)基因植株能更好的適應(yīng)逆境。本研究擬從高羊茅分離和鑒定抗病原菌性能較強(qiáng)的Ⅰ類幾丁質(zhì)酶基因及其啟動(dòng)子序列，為進(jìn)一步深入開(kāi)展抗病機(jī)理研究奠定相關(guān)的基礎(chǔ)。 首先應(yīng)用兼并PCR方法從真菌激發(fā)子處理的高羊茅中獲得一條保守的Ⅰ類幾丁質(zhì)酶基因cDNA片段，然后根據(jù)測(cè)定序列設(shè)計(jì)引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆了一條具有完整開(kāi)放閱讀框的cDNA全長(zhǎng)

4、序列。序列分析結(jié)果表明，該基因cDNA全長(zhǎng)共1172 bp，具有一個(gè)951bp的完整編碼框，將其命名為FaChitl，GenBank登錄號(hào)為EU837265。該cDNA編碼317個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量約為33.240 kDa，等電點(diǎn)為7.91，與大多數(shù)先前報(bào)道的其它植物的Ⅰ類幾丁質(zhì)酶的等電點(diǎn)一致。用Clustal W Program程序在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)FaChitl基因編碼產(chǎn)物和其它植物的Ⅰ類幾丁質(zhì)酶在氨基酸序列上具

5、有較高的同源性，包含典型的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)、催化區(qū)以及脯氨酸、半胱氨酸富集的鉸鏈區(qū)，但缺少定位到植物液泡所必須的的C末端延伸區(qū)靶向信號(hào)。 通過(guò)比較FaChitl基因的基因組序列與cDNA序列，發(fā)現(xiàn)FaChitl基因沒(méi)有內(nèi)含子。進(jìn)一步采用染色體步移技術(shù)分離了FaChitl基因上游的一段935 bp的啟動(dòng)子序列。分析結(jié)果顯示，該序列不僅含有保守的TATA—Box和CAAT—Box等基本的啟動(dòng)子元件，而且包含了多個(gè)潛在的與脅迫應(yīng)答有關(guān)的順

6、式調(diào)控元件，如W—box、ABRE、MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)以及低溫脅迫響應(yīng)元件等。這些調(diào)控序列的存在表明該啟動(dòng)子可能是一個(gè)多脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。Southern雜交結(jié)果表明高羊茅基因組中有2個(gè)FaChitl基因拷貝。 為了證實(shí)生物信息學(xué)分析結(jié)果，本工作檢測(cè)了高羊茅在真菌激發(fā)子、干旱、機(jī)械損傷以及乙烯等不同脅迫條件下FaChitl基因mRNA的積累水平。Northern雜交結(jié)果表明，F(xiàn)aChitl基因?qū)φ婢?/p>

7、發(fā)子有較強(qiáng)的響應(yīng)，無(wú)論在根中還是在葉片中，都具有較高的FaChitl—mRNA積累水平。乙烯和干旱脅迫均能誘導(dǎo)FaChitl基因的表達(dá)。在乙烯處理后，根及葉片中FaChitl—mRNA積累水平幾乎一致；但干旱脅迫處理后，根中的mRNA積累量要比葉片中的相對(duì)高一些。FaChitl基因?qū)C(jī)械損傷處理的反應(yīng)比較微弱，只在葉片中積累少量的mRNA。 進(jìn)一步構(gòu)建含不同長(zhǎng)度FaChitl啟動(dòng)子與GUS基因的植物表達(dá)載體，分別命名為pFaCh

8、itlP—Ⅰ、pFaChitlP—Ⅱ和pFaChitlP—Ⅲ，用于轉(zhuǎn)化煙草。對(duì)不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行真菌激發(fā)子、干旱、機(jī)械損傷以及乙烯等多種脅迫處理，測(cè)定GUS活性，發(fā)現(xiàn)真菌激發(fā)子誘導(dǎo)處理后-935 bp和-651 bp—FaChitl基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的GUS誘導(dǎo)表達(dá)活性為對(duì)照組的6.5及5.1倍，而-233 bp—FaChitl基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的GUS誘導(dǎo)表達(dá)活性很弱。干旱脅迫后，-935 bp、-651 bp、-233 bp—Fa

9、Chitl基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的GUS誘導(dǎo)表達(dá)活性分別為對(duì)照組的5.4、4.75及2.25倍。用乙烯噴灑處理后，-935 bp、-651 bp、-233 bp—FaChitl基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的GUS誘導(dǎo)表達(dá)活性分別為對(duì)照組的5.0、2.5及1.2倍。對(duì)于機(jī)械損傷脅迫，-935 bp、-651 bp—FaChitl基因啟動(dòng)子只能輕微誘導(dǎo)GUS表達(dá)，GUS誘導(dǎo)表達(dá)活性分別為對(duì)照組的2.4和2.1倍，而且-233 bp—FaChitl基因啟動(dòng)子不再能

10、誘導(dǎo)GUS表達(dá)。以上啟動(dòng)子缺失分析實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)aChitl基因啟動(dòng)子-935 bp與-233 bp之間的區(qū)域是該啟動(dòng)子響應(yīng)真菌激發(fā)子、乙烯以及機(jī)械損傷脅迫所必須的。 另外，設(shè)計(jì)并組裝了一套新型的DNA生物傳感器，用來(lái)對(duì)NPT—Ⅱ基因中特異片段進(jìn)行快速的檢測(cè)。在植物基因工程中，載體上的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因是迄今為止使用最廣泛的篩選標(biāo)記基因，因此通過(guò)對(duì)NPT—Ⅱ基因的檢測(cè)即可間接確認(rèn)各自所需轉(zhuǎn)化的目的基因是否整合到植物宿主細(xì)胞DNA