抗旱高羊茅品種FapDREB2基因克隆和WAX2基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、城市草坪在構(gòu)建優(yōu)美清潔的現(xiàn)代化城市方面擔(dān)當(dāng)著重要角色，在城市生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)能量循環(huán)及轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用。高羊茅(Festuca arundinaceum var．genuina Schreb．)是冷季型優(yōu)良草坪草種，廣泛用于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪、園林綠化、生物護(hù)坡等，在環(huán)境綠化與生態(tài)保護(hù)方面發(fā)揮重要作用，是我國(guó)目前使用量增長(zhǎng)最快的草種。但高羊茅的夏季生長(zhǎng)需水量較大，夏季干旱和高溫環(huán)境條件已成為限制其生長(zhǎng)的主要因素。提高環(huán)境的適應(yīng)性是目前高羊茅

2、育種的主要目標(biāo)之一。植物抗逆性狀非常復(fù)雜，往往與數(shù)量性狀位點(diǎn)連鎖，而高羊茅的遺傳背景復(fù)雜，基因組較大，采用傳統(tǒng)的育種方法獲得優(yōu)良抗性品種十分困難，基因工程技術(shù)為高羊茅抗性育種提供了便捷之徑。本論文從高羊茅抗旱性相關(guān)基因克隆和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化兩方面著手，希望可以在高羊茅抗性機(jī)理和基因工程育種方面開展一些有意義的工作。本論文主要研究?jī)?nèi)容如下： 1．明確了葉片表皮蠟質(zhì)含量與高羊茅抗旱性的關(guān)系 對(duì)14個(gè)經(jīng)受高溫干旱脅迫的高羊茅品種

3、進(jìn)行綜合抗旱性分析發(fā)現(xiàn)：在干熱脅迫下，高羊茅品種葉片表皮蠟質(zhì)含量與水分利用效率存在顯著正相關(guān)，高羊茅葉片氣孔附近的蠟質(zhì)成分對(duì)氣孔導(dǎo)度和胞間CO<,2>濃度有著顯著影響，在干熱脅迫時(shí)，高羊茅蠟質(zhì)含量可以通過對(duì)氣孔導(dǎo)度的調(diào)節(jié)來減少氣孔蒸騰，提高水分利用效率。逆境脅迫下蠟質(zhì)的積累在減少表皮蒸發(fā)的同時(shí)，對(duì)氣孔蒸騰也有重要影響。高羊茅品種的表皮蠟質(zhì)含量與抗旱性有密切相關(guān)性，因此建議今后將表皮蠟質(zhì)含量列為高羊茅抗旱性品種鑒定的新指標(biāo)。綜合抗旱性較好

4、且蠟質(zhì)含量較高的品種有：‘家園’(Plantation)和‘交戰(zhàn)Ⅱ’(Crossfire Ⅱ)。 2．克隆得到了高羊茅FapDREB2-cDNA 以干熱脅迫下抗旱性最好的高羊茅品種‘家園’為材料，利用Touchdown<'TM>PCR成功分離了FapDREB2的cDNA序列，該序列長(zhǎng)799 bp，包括一個(gè)連續(xù)的ORF，編碼262個(gè)氨基酸，含有DNA特異結(jié)合的AP2結(jié)構(gòu)域，基于序列同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)儆?/p>

5、DREB2基因家族。 組織特異性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)apDREB2基因在高羊茅葉片、葉鞘表達(dá)較強(qiáng)，而在其根中表達(dá)較弱。FapDREB2基因在干旱和高溫條件下的表達(dá)明顯強(qiáng)于沒有任何處理的對(duì)照。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)apDREB2基因的轉(zhuǎn)錄水平受干旱和高鹽脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，受低溫脅迫的微弱誘導(dǎo)，而ABA對(duì)其不起作用，表明FapDREB2通過不依賴ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與干旱、高鹽脅迫誘導(dǎo)反應(yīng)。FapDREB2基因受干旱和高溫環(huán)境脅迫誘導(dǎo)時(shí)，其轉(zhuǎn)

6、錄水平呈現(xiàn)不規(guī)則的變化，說明FapDREB2基因?qū)Ω珊岛透邷丨h(huán)境脅迫的反應(yīng)是復(fù)雜的。 3．建立了高羊茅種子內(nèi)生真菌消毒方法 以不同溫度(40℃，50℃，60℃)、不同時(shí)間(10 min，20 min，30 min)的溫水浸泡和次氯酸鈉配合使用處理高羊茅種子，并進(jìn)行發(fā)芽率試驗(yàn)和愈傷組織培養(yǎng)，結(jié)果顯示，適用于富含內(nèi)生真菌的高羊茅種子的最佳消毒組合為50℃溫水浸泡10min，再經(jīng)70％酒精處理5 min，然后用次氯酸鈉處理15

7、 min。本消毒方法在保證較高種子發(fā)芽力的前提下，降低種子污染率，提高出愈率。 4．分析了7個(gè)高羊茅品種出愈率和分化率的基因型差異 對(duì)過渡地帶常用的7個(gè)高羊茅品種的愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生研究發(fā)現(xiàn)，高羊茅的愈傷組織出愈率和分化率之間沒有等級(jí)相關(guān)性，基因型的差異對(duì)高羊茅出愈率和分化率有重要影響。出愈率和分化率都較好的高羊茅品種是‘愛瑞Ⅲ’(AridⅢ) 。 5．初步構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)高羊茅轉(zhuǎn)WAX2基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系

8、 以‘家園’、‘交戰(zhàn)Ⅱ’和‘愛瑞Ⅲ’作為WAX2基因的高羊茅愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，利用EHA105和LBA4404兩個(gè)農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因研究，獲得了7個(gè)轉(zhuǎn)WAX2基因的陽性植株。遺傳轉(zhuǎn)化研究發(fā)現(xiàn)，EHA105菌株與pCAMBIA-1300-multi質(zhì)粒配合使用的遺傳轉(zhuǎn)化效率高于LBA4404菌株與pCAMBIA-1300-multi質(zhì)粒配合，獲得抗性再生植株數(shù)較多，轉(zhuǎn)基因陰性植株較少。確定在EHA105菌株與p

9、CAMBIA-1300-multi質(zhì)粒配合的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，高羊茅轉(zhuǎn)化愈傷組織的潮霉素篩選濃度約為150 mg·L<'-1>。 本研究首次分析了高羊茅表皮蠟質(zhì)含量與抗旱性的關(guān)系，并確定蠟質(zhì)含量可列為高羊茅抗旱性品種鑒定的新指標(biāo)，這為利用生物技術(shù)手段提高高羊茅品種的蠟質(zhì)含量，改良高羊茅品種的抗旱性提供了重要理論依據(jù)。以14個(gè)高羊茅品種的抗旱性分析為基礎(chǔ)，一方面從高溫干旱環(huán)境脅迫下抗旱性較強(qiáng)的‘家園’中成功克隆出FapDREB2基因

10、cDNA，這將為改良高羊茅或其它資源植物的抗逆性提供優(yōu)良的基因資源。另一方面，綜合高羊茅品種抗旱性和愈傷組織出愈率、分化率，選取‘愛瑞Ⅲ’、‘家園’和‘交戰(zhàn)Ⅱ’作為轉(zhuǎn)化受體材料，首次將蠟質(zhì)相關(guān)基因WAX2導(dǎo)入3個(gè)高羊茅品種中，并從基因型、外植體材料的濕熱消毒方法、農(nóng)桿菌菌株、潮霉素抗性篩選濃度等方面進(jìn)行了探討，為高羊茅的抗旱基因工程育種與遺傳改良奠定了基礎(chǔ)，將有助于抗逆性(抗旱、耐熱)優(yōu)良高羊茅品種的培育。本研究工作對(duì)于推動(dòng)我國(guó)草坪業(yè)的