免疫共沉淀蛋白芯片分析方法及其應用的研究.pdf

1、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是一種以抗體和抗原之間的特異性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的常規(guī)方法，可用來確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的存在與否。針對免疫共沉淀檢測方法相對繁瑣、操作誤差大、結果不易數(shù)字化等弱點，本文第一部分建立了一種基于芯片的免疫共沉淀技術檢測蛋白-蛋白相互作用的分析方法，該方法結合傳統(tǒng)的免疫共沉淀和蛋白質陣列芯片技術的優(yōu)勢，快速檢測蛋白-蛋白之間的相互作用。此方法將nl級

2、的anti-Flag M2抗體固定在醛基修飾的芯片表而，利用重組蛋白的表位標簽將帶有Flag誘餌蛋白和Myc獵物蛋白的細胞裂解液在芯片上進行免疫沉淀反應，通過熒光標記的anti-Myc抗體檢測免疫共沉淀的蛋白，采用熒光芯片掃描儀可獲得蛋白-蛋白相互作用的信號。
　　 本文第二部分介紹一種可視化免疫共沉淀芯片檢測技術。在免疫共沉淀芯片技術的基礎上結合銀染色放大和免疫膠體金技術實現(xiàn)了可視化檢測。該方法無需借助昂貴的檢測儀器即可觀察到

3、相互作用信號。通過生物素與鏈親和素的強結合能力使樣品標記上膠體金，最后使用銀增強顯色液顯色，一旦銀增強試劑加入，樣品點上的膠體金則作為一個催化試劑催化銀離子的還原反應發(fā)生。被還原出來的銀以膠體金為沉積位點不斷的積聚直到出現(xiàn)肉眼明顯可見的黑色信號?？梢暬庖吖渤恋硇酒瑱z測技術為我們提供了一個檢測蛋白-蛋白相互作用的有效平臺，該技術快速、靈敏、可實現(xiàn)高通量的檢測。使用銀增強顯色技術使結果可視化，避免了使用價格昂貴的熒光掃描儀。
　　

4、 本文第三部分我們成功地將酪胺信號放大系統(tǒng)和銀增強方法相結合，開發(fā)出一種蛋白芯片的高靈敏度的顯色檢測方法。利用目標分子團上的HRP酵素將帶有被生物素標記過的Tyramide催化后形成自由基，此自由基會與目標分子附近的Tyrosine結合，導致每一個目標分子團上有多個被標記過的Tyramide，從而達到信號放大的效果。研究實驗通過雙抗夾心的模式，對各項實驗參數(shù)進行了優(yōu)化，其中包括固定抗體的濃度，檢測抗體的濃度，鏈親和素標記的辣根過氧化物酶