基因芯片雜交質(zhì)控方法的設(shè)計研究.pdf

1、基因芯片技術(shù)是上世紀(jì)90年代興起，源于計算機集成化芯片理念的一門新技術(shù)。其實質(zhì)就是利用Southern blot原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達的信息。該技術(shù)的出現(xiàn)為基因表達譜分析、新基因的發(fā)現(xiàn)、基因突變檢測、多態(tài)性分析、基因組作圖等提供了強有力的工具，使疾病的基因診斷、藥物篩選等方面取得了重大突破。然而在基因芯片技術(shù)的推廣及應(yīng)用

2、中，發(fā)現(xiàn)其實驗結(jié)果容易受到來自芯片樣品的準(zhǔn)備、探針的打印、芯片的雜交、芯片的雜交后清洗、熒光信號采集等多個步驟因素的影響。因此需要嚴(yán)格控制芯片的實驗流程，從而得到更科學(xué)更可信的實驗數(shù)據(jù)。 芯片實驗流程中最初始的階段是樣品的制備，也是影響后續(xù)實驗效果的首要因素。樣品（DNA或mRNA）的制備包括樣品的分離純化，擴增和標(biāo)記等過程。分離純化是芯片實驗的第一步，也是最重要的一步，樣品的質(zhì)量會直接影響后面實驗的效果，需要應(yīng)用實驗儀器對分離

3、得到的樣品進行有效的檢測，保證得到的樣品質(zhì)量。在樣品的標(biāo)記過程中，目前使用最多的仍然是熒光標(biāo)記。生物素標(biāo)記法和放射性同位素標(biāo)記法由于操作過程的復(fù)雜性和檢測的要求更高，因此相對沒有熒光標(biāo)記應(yīng)用的更為廣泛。傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記法有逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法和隨機引物延伸法，在限制性擴增的基礎(chǔ)上引進了通用引物限制性標(biāo)記法，以及線性擴增熒光標(biāo)記法。線性擴增標(biāo)記因為能夠如實反映樣品的表達豐度，解決了非線性標(biāo)記中出現(xiàn)的無法精確定量的缺陷，避免了不同基因表達豐度的微小差

4、異由于PCR的幾何擴增而擴大化，并且線性熒光標(biāo)記法對核酸樣品標(biāo)記時所需要的初始樣品量的波動范圍在50ng至5μg之間，遠遠少于其他標(biāo)記方法，非常適合某些稀有核酸樣品的標(biāo)記，因此在生物芯片的樣品標(biāo)記領(lǐng)域逐漸得到廣泛應(yīng)用。 探針的打印是將預(yù)先制備好的核酸探針置于96孔或384孔板內(nèi)，以液滴的形式有序排列在經(jīng)特殊處理的支持物上的過程。一個微集陣列打印系統(tǒng)需要穩(wěn)定的硬件和精確的軟件支持，從而保證芯片片基打印上的點陣能夠正確反映樣品的陣列

5、排列。而影響陣列打印效果的最主要因素就是濕度和灰塵，高密度的微集陣列必須控制這兩個因素，控制濕度以防止探針在打印過程中從樣品板或打印針的細槽中蒸發(fā)。 對芯片技術(shù)的廣泛研究建立了很多技術(shù)層面的方法來改善實驗的效果，包括芯片陣列的設(shè)計，樣品的標(biāo)記方法的改進等，而樣品雜交方法的選擇則相對報道較少，其中一個原因就是Corning的CMT芯片雜交盒已經(jīng)在芯片實驗領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，其實驗的操作流程即將樣品點到芯片陣列表面，調(diào)節(jié)一定的溫度，雜

6、交過夜即可。但是在芯片雜交過程中，由于液體表面張力的存在，會造成樣品液滴在陣列表面呈現(xiàn)不均勻的分布，常常在液滴的邊緣樣品的量要低于中間的樣品量，并且在雜交后的芯片掃描圖上常常出現(xiàn)邊緣效應(yīng)（Edge-effect），從而影響對芯片雜交圖像的分析。目前芯片雜交可以采取一種動態(tài)循環(huán)的方法中通過樣品和芯片陣列表面進行接觸來進行雜交反應(yīng)，保證陣列上液-固相雜交反應(yīng)的隨機性，并且避免了液體表面張力的影響，單位體積內(nèi)的樣品與單位面積的陣列反應(yīng)的概率相

7、同，使得到的芯片數(shù)據(jù)更科學(xué)。 芯片的高通量一方面是是芯片技術(shù)的優(yōu)勢，另一方面也容易造成實驗中芯片結(jié)果的不準(zhǔn)確，以及如何進行數(shù)據(jù)分析的困難：在芯片實驗過程中，選擇不同的芯片片基，不同的標(biāo)記雜交方法，以及所采用的不同的芯片雜交清洗平臺，都會影響芯片實驗的結(jié)果。因此，針對影響芯片實驗的各種因素，需要對芯片實驗過程進行質(zhì)量控制（Quality assurance plan），來消除外加或操作因素產(chǎn)生的偽信號，提高芯片數(shù)據(jù)的科學(xué)性和可信性

8、。目前的研究主要是從兩個方面來進行：一是集中于具體樣品標(biāo)記方法、雜交方法等各個因素的改進，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)化實驗流程，來提高雜交信號的信噪比；二是結(jié)合生物信息學(xué)的思路和方法對芯片實驗結(jié)果進行更有效的數(shù)據(jù)挖掘。但是前一種思路過于集中于單一環(huán)節(jié)的研究，無法從整體角度對芯片實驗過程和數(shù)據(jù)進行科學(xué)分析，而生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)挖掘又需要設(shè)計復(fù)雜的計算機軟件和程序，增加了生物學(xué)工作研究的難度。因此，如何能夠從芯片實驗設(shè)計的角度，來對芯片實驗整體過程進行質(zhì)

9、控分析，有待于深入研究。本研究立足于芯片的質(zhì)控設(shè)計，探討和研究不同的芯片質(zhì)控方法在芯片探針檢測的應(yīng)用，并設(shè)計一種互雜交（Cross-hybridization）的實驗方法，研究從實驗整體設(shè)計出發(fā)提高芯片實驗科學(xué)性的思路；同時在芯片雜交體系方面根據(jù)已有的實驗平臺原理，提出了夾心法的芯片雜交體系，為提高芯片重復(fù)性實驗的數(shù)據(jù)科學(xué)性和可信性提供新的實驗方法和研究思路。 本研究包括以下三個部分： 一．自雜交方法在生物芯片質(zhì)控中的應(yīng)

10、用 應(yīng)用RD-PCR技術(shù)構(gòu)建人紅白血病K562細胞正常生長情況下cDNA片段文庫，從中選擇克隆擴增，PCR產(chǎn)物應(yīng)用Pixsys5500芯片打印儀進行點樣，然后在BIO-RAD紫外交聯(lián)儀下進行交聯(lián)固定。同時提取K562細胞的總RNA，純化后的mRNA分成兩等份，應(yīng)用通用引物限制性擴增標(biāo)記方法分別標(biāo)記熒光Cy3和Cy5，標(biāo)記后的核酸樣品和芯片進行雜交反應(yīng)，然后在掃描儀下進行熒光信號的采集和數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芯片陣列的探針

11、信號清晰，背景相對較小，在雜交時兩種相同基因片段，得到的探針信號為Cy3和Cy5紅綠兩種熒光顏色的疊加，由于兩種熒光分子的大小不同，Cy5分子摻入cDNA鏈的效率比Cy3分子低，因此在芯片雜交圖上的探針信號顯示為偏黃色。在Cy3樣品/Cy5樣品分別為4/10，6/10，和8/10的不同比例下，芯片探針的兩種熒光強度在8/10的濃度比例最為接近。因此，自雜交方法可以有效地檢測樣品的標(biāo)記效率，但是通過探針的兩種熒光強度差異來評估芯片本身的質(zhì)

12、量，從而用于芯片的質(zhì)控，仍然需要避免不同熒光之間本身的差異；并且對于單通道的芯片實驗，由于雜交時每種熒光物質(zhì)標(biāo)記的樣品是單一性的和一張芯片進行雜交，因此無法應(yīng)用比較兩種熒光強度的自雜交方法來對芯片的實驗效果進行檢測。 二．互雜交方法的芯片質(zhì)控設(shè)計研究 分離正常培養(yǎng)的K562細胞和青蒿素處理的K562細胞，提取其單個核細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行熒光標(biāo)記，生成的cRNA再進行純化，純化后的兩組樣品各分成兩等份，然

13、后分別與安捷倫全基因組芯片進行雜交，操作同步驟進行，然后芯片掃描儀以及FeatureExtraction軟件進行探針熒光信號的采集，采取四分位法對探針信號強度平衡至相同的信號強度均值，達到片間標(biāo)準(zhǔn)化，然后比較每組內(nèi)樣品的兩次芯片雜交結(jié)果的重復(fù)性，和四張芯片整體熒光探針的檢測率，兩兩分析兩組樣品組間以及組內(nèi)兩次實驗的探針信號強度。 我們發(fā)現(xiàn)每兩組芯片的探針檢測率，即這兩組共同檢測出的探針數(shù)量與其探針平均數(shù)量的比值，分析芯片的探針檢

14、測重復(fù)性，在相同的樣品間的一致性明顯好過不同樣品之間的比較結(jié)果。而在四分位法標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，分析每組樣品內(nèi)兩張芯片得到的探針信號強度，對照組中18235個探針被共同檢測到，而有194個探針（1．1%）成為差異探針，兩次實驗數(shù)據(jù)相關(guān)性達到0．983，在處理組有19129個探針被檢測到，有287（1．5%）成為差異探針，相關(guān)性為0．972。本研究通過對基因芯片實驗得到的數(shù)據(jù)進行交叉分析和驗證，包括探針檢測率和信號強度相關(guān)性的比較，以求能

15、夠?qū)π酒瑱z測得到的數(shù)據(jù)，特別是兩組樣品具有同源性時實驗數(shù)據(jù)的整理與驗證提出新的思路和方法，提高芯片實驗數(shù)據(jù)的可信度。 三．雜交體系對基因芯片探針熒光信號的作用研究 提取人慢性髓系白血病K562細胞株的mRNA，純化后在紫外分光光度儀進行定量，純化后的mRNA應(yīng)用Cy5通用引物進行限制性擴增和熒光標(biāo)記。然后在分成15μL的三等份，分別在CMT芯片雜交盒，安捷倫芯片雜交儀以及GeneTac自動化雜交儀中進行和K562 cDN

16、A芯片雜交，使用安捷倫2565芯片掃描儀對雜交后的芯片結(jié)果進行掃描，分析三種不同雜交體系下的探針熒光信號強度，采用單向方差分析比較差異顯著性，并對其進行多重比較，來評價三種雜交體系對探針信號強度的影響。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用自制的K562 cDNA芯片對設(shè)計的夾心法雜交體系進行驗證，在芯片雜交時將樣品置于兩張芯片間同時進行雜交反應(yīng)，并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對得到的差異表達基因進行定量分析，從而為芯片重復(fù)性實驗提供新的實驗方法和思路。 我

17、們發(fā)現(xiàn)將探針信號強度/背景信號強度大于等于2界定為陽性探針，利用計數(shù)資料的卡方檢驗來對陽性探針檢測率進行分析，發(fā)現(xiàn)其三者之間的統(tǒng)計學(xué)差異具有顯著性。同時對探針熒光強度的比較分析后發(fā)現(xiàn)，三種雜交體系信號強度差異具有顯著性，Agilent和GeneTac兩種雜交體系中的探針的信噪比更高。進一步研究，在我們設(shè)計的夾心法實驗得到的兩張芯片中Cy3和Cy5的熒光信號一致性非常高，同時應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對得到的差異表達基因進行定量分析，與我們芯片