基因芯片定量PCR的研究.pdf

1、熒光定量PCR是近年來新發(fā)展起來的PCR新技術(shù),為基因定量分析的發(fā)展起到了巨大的推動(dòng)作用。現(xiàn)有的熒光定量PCR技術(shù)主要基于熒光能量傳遞技術(shù)[1](fluoresce nceresonance energy transfer, FRET)而發(fā)展起來的,該技術(shù)可以通過增加不同范圍波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)多種靶基因序列的定量分析。但因可使用的標(biāo)記的熒光基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)帶寬與檢測(cè)波長(zhǎng)帶寬范圍的限制,目前最多可同時(shí)檢測(cè)的靶基因序列不多,無法實(shí)現(xiàn)真正意義

2、上的高通量檢測(cè)。針對(duì)這一現(xiàn)狀,本實(shí)驗(yàn)研究小組在基因芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展了TaqMan微陣列芯片檢測(cè)技術(shù)[2],該技術(shù)不受檢測(cè)波長(zhǎng)等的限制,初步實(shí)現(xiàn)了基因的多位點(diǎn)定量分析。本論文以該芯片定量分析技術(shù)為基礎(chǔ),進(jìn)一步發(fā)展建立了基于通用熒光探針的微陣列定量PCR分析技術(shù),為生物分子的定量分析檢測(cè)平臺(tái)的建立打下了基礎(chǔ)。 本論文的主要研究?jī)?nèi)容有： 1. 通用熒光探針體系的建立。通過多重在片PCR體系中特異引物和通用熒光探針(引物)比例及

3、濃度的優(yōu)化,發(fā)展建立了單熒光基團(tuán)標(biāo)記通用探針的多重在片PCR擴(kuò)增體系。該通用探針定量體系大大降低了實(shí)驗(yàn)成本,拓寬了該定量技術(shù)的應(yīng)用范圍。 2. 熒光衰減與初始模板量數(shù)學(xué)關(guān)系的建立。在熒光定量分析中,初始靶標(biāo)的濃度往往與熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究中采用了基于能量傳遞的單熒光基團(tuán)標(biāo)記技術(shù),根據(jù)PCR動(dòng)力學(xué)原理,推導(dǎo)出熒光衰減率(熒光信號(hào)減弱的絕對(duì)值與芯片背景值的比率)與初始模板最存在線性關(guān)系,利用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行的多重在PCR擴(kuò)增亦獲

4、得一致結(jié)果,故熒光強(qiáng)度的衰減也可用于定量分析。 3. 全封閉的通用定量檢測(cè)體系的建立。通過對(duì)包含有五對(duì)標(biāo)準(zhǔn)模板的多樣本多引物在片PCR體系的擴(kuò)增優(yōu)化,采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行PCR定量分析,繪制出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)讓實(shí),該方案避免了現(xiàn)有定量PCR外標(biāo)法管間的差異,減小實(shí)驗(yàn)誤差,提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的可靠性。通過實(shí)驗(yàn)研究,本研究進(jìn)一步讓實(shí)了基因芯片定量PCR分析方法的可行性,并確立了在該技術(shù)中的通用探針和定量方案；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,得到了一組可進(jìn)