新型探針原位延伸基因芯片的構(gòu)建研究.pdf

1、前言
　　 基因芯片技術(shù)自上世紀(jì)末誕生以來,取得迅速發(fā)展,并已廣泛應(yīng)用到了基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預(yù)測、遺傳病相關(guān)基因分析、藥物篩選、基因測序、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析等多個(gè)領(lǐng)域。盡管所有的DNA微陣列都是基于核酸鏈的雜交,但就這種設(shè)計(jì)間的不同卻也產(chǎn)生了較大結(jié)果差異。目前的基因芯片技術(shù)主要包括四個(gè)主要步驟:芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)和結(jié)果分析,而絕大多數(shù)的基因芯片僅雜交反應(yīng)又出現(xiàn)兩個(gè)

2、甚至多個(gè)步驟,因此常規(guī)芯片復(fù)雜性較高,使得基因芯片的可操作性差、特異性不高。本實(shí)驗(yàn)室利用HBV基因分型實(shí)驗(yàn)開發(fā)出一種新型的探針原位延伸基因芯片以提高檢測的可操作性、準(zhǔn)確性、特異性及高效性。
　　 隨著HBV基因分型方法的不斷發(fā)展,目前主要有四種分型方法:1.全基因序列測定2.S基因序列測定3.PCR-RFLP分析法4.單克隆抗體ELISA基因型分型法,其中測序方法是鑒定基因型的金標(biāo)準(zhǔn)。但不論是利用全基因序列,還是利用S基因序列分

3、型,均不可避免面臨大量序列測定的實(shí)際困難,其它傳統(tǒng)方法也因操作復(fù)雜并且不適合變異的HBV檢測而具有一定的局限性,而近年發(fā)展起來的基因芯片則可對HBV分型進(jìn)行高通量、平行化、自動(dòng)化檢測。該技術(shù)將事先設(shè)計(jì)好的大量HBV探針同時(shí)固定于支持物上,通過單一的雜交試驗(yàn)就可以完全分型,并能對大量基因同時(shí)進(jìn)行檢測。但是,傳統(tǒng)的基因芯片方法存在其特異性不高,操作復(fù)雜,對于單個(gè)基因的改變檢測能力差等弱點(diǎn),在臨床應(yīng)用上也存在一定的限制。
　　 本研究

4、構(gòu)建了一種新型的基因分型方法。其原理在于當(dāng)PCR引物的3’端堿基與模板堿基出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí),PCR反應(yīng)將不會進(jìn)行,根據(jù)這一原理,將基因型特異的探針固定到芯片上,并且在芯片上進(jìn)行PCR反應(yīng),下游引物帶有熒光信號,然后檢測芯片上的熒光信號來達(dá)到分型的目的。利用此種方法雜交反應(yīng)一步完成降低了常規(guī)芯片的操作復(fù)雜性,提高了檢測的特異性,并可以對單個(gè)基因的突變進(jìn)行檢測,為進(jìn)行SNP分析打下基礎(chǔ)。
　　 由于HBV基因型與該病的地域分布、臨床疾病譜

5、、治療方案及預(yù)后判斷都有一定相關(guān)性,所以開發(fā)簡便、有效的基因分型方法有很大的實(shí)用價(jià)值。目前國內(nèi)對基因芯片的報(bào)道諸多,但尚沒有成熟的HBV芯片應(yīng)用到臨床,并且我國的基因型研究開展較少,現(xiàn)有的報(bào)道其結(jié)果也并不完全一致,所以本研究將基因芯片技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合,利用HBV全基因型分型實(shí)驗(yàn)構(gòu)建一種新型基因芯片。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 含HBV血清樣本(由沈陽市第六人民醫(yī)院肝病研究室提供)
　　

6、 HBV特異基因片段(A-H亞型)(由本實(shí)驗(yàn)室篩選合成)
　　 原位延伸基因芯片盒(本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì))
　　 特異性粘合劑(703硅膠粘合劑)
　　 感受態(tài)JM109菌,pMD-18T質(zhì)粒,rTaq酶
　　 限制性內(nèi)切酶EcoRI、NcoI,VentR-(exo-)DNA聚合酶
　　 質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物切膠回收試劑盒
　　 PCR擴(kuò)增儀(Biometra Personal PCR

7、system,Germany)
　　 生物芯片點(diǎn)樣儀(Micro Grind Ⅱ 600,Biorobtics Ltd,England)
　　 熒光圖像掃描儀(Gene TACTM LS Ⅳ,Genomic Solutions Inc.USA)
　　 空氣變溫PCR擴(kuò)增儀(實(shí)驗(yàn)室自制)
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、在NCBI數(shù)據(jù)庫中收集A-H八種基因型HBV的全基因組序列。利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行

8、分析比對,篩選出分型位點(diǎn)。
　　 2、根據(jù)選擇的位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針及引物,并且分析其特異性。
　　 3、由含HBV血清中提取病毒DNA樣本,測序,并通過生物信息學(xué)確定其亞型。
　　 4、制備基因芯片:處理片基,按預(yù)先設(shè)計(jì)好的微陣列點(diǎn)陣使用生物芯片點(diǎn)樣儀將探針點(diǎn)到芯片上,水化,烘烤固定并且與基因芯片盒組裝備用。
　　 1、利用血清中提取的DNA樣本與相應(yīng)探針在液相及原位延伸芯片盒中反應(yīng)尋找最佳反應(yīng)條件。
　

9、　 2、SOEing法制備包含分型堿基位點(diǎn)的A-H亞型特異核酸片段作為擴(kuò)增模板優(yōu)化反應(yīng)程序,并對芯片結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 3、把芯片結(jié)果與測序結(jié)果做對照分析芯片探針的特異性、準(zhǔn)確性并多次試驗(yàn)驗(yàn)證其重復(fù)性。
　　 結(jié)果
　　 1、篩選并設(shè)計(jì)出了與其他細(xì)菌、病毒等無同源性的高度優(yōu)化的分型相關(guān)引物及探針。
　　 2、通過血清DNA與探針的液相反應(yīng)驗(yàn)證了探針的捕獲能力及準(zhǔn)確性。
　　 3、優(yōu)化了部分亞型

10、與探針特異結(jié)合的反應(yīng)條件。
　　 4、HBV基因的芯片分型結(jié)果與測序結(jié)果一致,證實(shí)了芯片的可靠性。
　　 5、簡化了常規(guī)基因芯片的操作步驟,實(shí)現(xiàn)了單堿基差異的檢測。
　　 6、多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致證實(shí)了芯片良好的重復(fù)性。
　　 結(jié)論
　　 1、新型探針原位延伸基因芯片通過初步驗(yàn)證具有良好的可行性和可操作性。
　　 2、設(shè)計(jì)專門用于該基因芯片的空氣變溫PCR擴(kuò)增儀及原位延伸基因芯片盒,能夠簡化常