納米金復(fù)合探針結(jié)合基因芯片在鑒別結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，簡稱結(jié)核桿菌)引起的經(jīng)呼吸道傳播的全身性慢性傳染病，其在全球廣泛流行，嚴(yán)重危害人類健康，已成為全球重大公共衛(wèi)生問題和社會問題。因此，建立快速、高效、特異的檢測結(jié)核分枝桿菌新方法勢在必行。
　　 近幾年來，核酸檢測中應(yīng)用納米金顆粒替代目前通用的熒光、同位素等信號分子已比較普遍。大量實(shí)驗(yàn)表明，納米金復(fù)合探針因具有穩(wěn)定性高、標(biāo)記密度高和雜交效率高等特點(diǎn)而廣泛

2、用于核酸檢測。因此，本研究將納米技術(shù)與基因芯片技術(shù)有機(jī)結(jié)合在一起，在此基礎(chǔ)上建立了兩種目視化核酸檢測新方法，即基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法與基因芯片交聯(lián)放大銀染檢測法，為分子生物學(xué)領(lǐng)域提供了快速、簡便、高靈敏度的檢測病原細(xì)菌新方法。
　　 本實(shí)驗(yàn)室采用經(jīng)典檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備納米金顆粒。基于納米金顆粒與疏基修飾的寡核苷酸共價(jià)結(jié)合作用及與蛋白分子的吸附作用，我們構(gòu)建了不同種類的納米金復(fù)合探針，并且通過透射電子顯微鏡(TEM)和紫外吸

3、收光譜對納米金顆粒及納米金復(fù)合探針進(jìn)行形貌觀察和表征分析。
　　 本研究首先利用堿基互補(bǔ)配對原則使納米金復(fù)合探針與靶DNA分子在芯片表面形成央心復(fù)合結(jié)構(gòu)，再用膜轉(zhuǎn)印法或銀染法將芯片上不易觀察的結(jié)果信號轉(zhuǎn)化成易檢測信號，最后通過普通光學(xué)掃描儀讀取信號結(jié)果或肉眼直接判讀信號有無來判斷靶DNA的有無。
　　 結(jié)果：表明，透射電子顯微鏡觀察所制備的納米金顆粒，其粒徑為(13±2)nm，形貌呈球形，大小均勻，分散良好；制備的納米金

4、復(fù)合探針形態(tài)完好，分散均勻，穩(wěn)定性好。通過紫外分光光度計(jì)在521nm處的吸光度計(jì)算出所制備納米金溶液的濃度為12.5 nmol/L。當(dāng)納米金顆粒表面信號探針與檢測探針摩爾比為10:1，兩種信號探針(T10，T40)摩爾比為9:1時(shí)，運(yùn)用基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法肉眼可檢測0.23pmol/L的結(jié)核分枝桿菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或l pmol/L的合成靶DNA分子。在優(yōu)化交聯(lián)納米金復(fù)合探針使用量和銀染增強(qiáng)時(shí)間條件下，基因芯片交聯(lián)放大銀

5、染檢測法可肉眼檢測10 fmnol/L，的合成靶DNA。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)用納米金復(fù)合探針結(jié)合基因芯片技術(shù)的兩種核酸檢測新方法，具有操作簡單，靈敏度高，特異性好和無需特殊儀器設(shè)備等特點(diǎn)。通過運(yùn)用納米金復(fù)合探針不僅利于雜交反應(yīng)，而且通過標(biāo)記不同的標(biāo)記物，將基因芯片上不易檢測的結(jié)果信號轉(zhuǎn)化為可目視化檢測的信號。因此，基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法與基因芯片交聯(lián)放大銀染檢測法均是較好的結(jié)核分枝桿菌檢測新方法，在生物分子檢測方面具有較高