卵巢癌相關(guān)抗原CA125膠體金免疫層析檢測方法的初步建立.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器最常見的三大惡性腫瘤之一，因其發(fā)病初期無典型臨床癥狀，多數(shù)患者就診時已處于患病晚期。因此，如何在卵巢癌發(fā)病早期準確診斷就顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，糖類抗原125（Carbohydrate antigen125，CA125）作為婦科臨床最常用的血清型腫瘤標志物，對上皮性卵巢癌具有一定的特異性和敏感性，在卵巢癌的預(yù)防、輔助診斷、病情評估以及術(shù)后療效等方面具有非常積極的意義，可作為卵巢癌防治的主要監(jiān)測指標。目前CA125的檢測

2、技術(shù)主要有化學(xué)發(fā)光法及酶聯(lián)免疫法等，所使用的檢測試劑盒大多為昂貴的進口或國內(nèi)分裝試劑，且檢測時均需依賴相關(guān)檢測儀器在實驗室進行，檢測成本較高，不適合于基層醫(yī)院進行大規(guī)模初篩和床旁快檢。因此，急需尋找一種簡便、快速的檢測技術(shù)，為臨床診斷提供依據(jù)。
　　本研究采用正辛酸-硫酸銨沉淀法純化CA125包被和標記單克隆抗體，經(jīng)透析后用紫外分光光度計測定280nm處吸光值，根據(jù)經(jīng)驗公式計算出兩種抗體的蛋白濃度，再通過SDS-PAGE對兩株抗體

3、進行純度鑒定。采用檸檬酸三鈉還原法并控制檸檬酸三鈉加入量的不同而制備不同粒徑的膠體金，對其最適粒徑、膠體金制備工藝、標記pH、最佳標記蛋白量、金標稀釋液加入量、硝酸纖維素膜、樣品墊處理液、劃膜液和最佳包被抗體量等因素進行選擇優(yōu)化，并對試紙條的穩(wěn)定性、特異性、靈敏度進行性能研究及實驗室臨床標本評價，制備出能快速檢測人血清中CA125的膠體金檢測試紙。
　　實驗結(jié)果表明，純化后獲得的抗體純度較高，其中每3mL抗體腹水純化后獲得1mLC

4、A125包被抗體，濃度為14.93mg/mL，1.15mL標記抗體，濃度為15.08mg/mL。采用的24.5nm膠體金顆粒相對均一，且性能穩(wěn)定。膠體金制備的最優(yōu)工藝為:加熱至沸騰時間8min，200rpm最大轉(zhuǎn)速，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5min。通過反應(yīng)模式優(yōu)化，建立了膠體金檢測試紙條工藝:膠體金與蛋白標記pH為7.5，標記蛋白濃度為1.4mg/mL，金標稀釋液加入量為300μL/mL，NC膜選用TEST NC膜，樣品墊處理液最佳配方組合

5、為0.03MpH8.8 Tris、0.3％Tween-20、0.5％pvp、0.3％檸檬酸，質(zhì)控線和檢測線包被蛋白濃度1.5mg/mL，以此方法建立的試紙條靈敏度為35U/mL，且不與CEA、AFP、CA50、CA15-3、CA19-9發(fā)生交叉反應(yīng)，37℃加速破壞實驗21d后顯示該試紙條穩(wěn)定性良好。臨床評價結(jié)果顯示:200份臨床標本的檢測陽性符合率100/100，陰性符合率98/100。
　　本研究成功建立了CA125膠體金免疫層