套式RT-PCR檢測狂犬病毒方法的建立及其在上海地區(qū)犬、貓唾液樣本的應(yīng)用.pdf

1、建立了狂犬病毒的套式RT-PCR檢測方法，可以特異地檢測出狂犬病毒ERA毒株的RNA，而對犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)和犬冠狀病毒(CCV)均呈陰性。該法能檢出0.18fg的RNA，敏感性是普通RT-PCR的10000倍。并且檢測了分別用PBS液和人唾液稀釋的陽性腦組織病料，結(jié)果表明PBs液稀釋的陽性病料和唾液稀釋的陽性病料的檢測結(jié)果是一致的，凝膠電泳觀察均可以觀察到特異的46

2、0bp的條帶。研究表明應(yīng)用套式RT-PCR法是可以檢測出唾液中的狂犬病毒的。 對廣西送檢的疑似狂犬病的20份犬的腦組織進行RT-PCR檢測，比較了套式RT-PCR和普通RT-PCR兩種方法的陽性檢出率。套式RT-PCR檢出15份陽性，陽性率達到75％，測序結(jié)果表明15份陽性條帶的序列為狂犬病毒的核酸序列，其中4個代表株與狂犬病毒ERA毒株的同源性在85.1％～85.5％之間；與狂犬病毒CVS株的同源性在85.9％～87％之間；相

3、互間同源性在98％～99.6％之間，而普通RT-PCR檢測沒有出現(xiàn)任何條帶。表明套式RT-PCR法在臨床應(yīng)用中可極大提高狂犬病毒的檢出率，是實用的檢測方法。 摸索了犬唾液樣本的保存條件。通過對緩沖液的初步篩選，選定人唾液、PBS液+2％FCS(犢牛血清)和Hanks液+2％FCS作為樣品保存的候選緩沖液，分別以這三種緩沖液為基礎(chǔ)，不同保存時間，及不同溫度保存，比較套式RT-PCR可以檢測到病毒的最大稀釋滴度。結(jié)果表明，PBS液+

4、2％FXS最有利于狂犬病毒ERA毒株的保存；唾液其次；Hanks液+2％FCS雖然理論上緩沖能力最強，但是最不利于狂犬病毒ERA毒株的保存。在2日內(nèi)可以檢測的樣本，應(yīng)當4℃保存，避免凍融對病毒產(chǎn)生的損害；一周以內(nèi)可以檢測的樣本應(yīng)當加入抗生素，保存在-20℃；超過一周再檢測的樣本應(yīng)當保存在-70℃，保存在-20℃雖然對套式RT-PCR檢測影響不大，但是病毒量還是有所下降的。 2005年9月至2006年3月，對上海地區(qū)外觀健康的犬、