Ⅰ型鴨肝炎病毒ZJ-V株基因組全序列解析與RT-PCR檢測方法建立.pdf

1、根據(jù)已發(fā)表的Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒(Duck virual hepatitis virus type Ⅰ，DHV-I)的基因組序列，設(shè)計(jì)并合成了覆蓋DHV-I全基因組序列的5對特異性引物。利用RT-PCR方法擴(kuò)增DHV-I ZJ-V株基因組的各片段。其中，病毒基因組3′末端序列的擴(kuò)增是通過RACE方法得到。將擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆于pMD-18T載體中進(jìn)行測序，并利用分子生物學(xué)軟件對ZJ-V株序列進(jìn)行了分析。 1.ZJ-V 株全基因組由

2、7691個(gè)核苷酸組成，基因組中只含有一個(gè)大的閱讀框架(ORF)(627nt-7373nt)，與03D株序列比對顯示，ZJ-V株沒有發(fā)生堿基插入或缺失；且在其基因組5’端有一個(gè)長達(dá)626nt的非編碼區(qū)(NCR)，3’NCR含有318個(gè)核苷酸(不包括poly(A)尾巴)。 2.ZJ-V株VP1基因大小為714 bp，它與參考毒株具有93.3％～95.9％的核苷酸同源性和92.9％～95.0％的氨基酸同源性，VP1氨基酸變異主要表現(xiàn)為

3、羧基端出現(xiàn)多處氨基酸置換，如：S<,181>→L<,181>、E<,205>→K<,205>、R<,217>→K<,217>、N<,235>→D<,235>，提示VP1可能含有DHV-I的毒力相關(guān)的位點(diǎn)。 3.根據(jù)VP1的氨基酸序列，繪制了不同DHV-I分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，所有的DHV-I分離株可以分為2個(gè)大的基因群(GⅠ、GⅡ)。其中多數(shù)DHV-I浙江分離株屬于GⅡ，該群中的DHV-I均沒有經(jīng)過組織培養(yǎng)，其序列皆直接

4、來自于臨床病料；GⅠ中所有的DHV-I分離株均為組織適應(yīng)毒株，且3株中國DHV-I弱毒疫苗株自成一個(gè)基因亞群。該結(jié)果提示DHV-I流行毒株經(jīng)過一定代次的組織培養(yǎng)后，可以發(fā)生適應(yīng)性突變，并有可能導(dǎo)致DHV-I致病力變?nèi)酢?4.利用RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件對DHV-I非編碼區(qū) (Non coding region，NCR)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測分析。結(jié)果表明，ZJ-V株5′NCR 的二級結(jié)構(gòu)與RDL-62株相似，都存在一些保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)

5、區(qū)。DHV-IZJ-V株3′NCR 可形成4個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(SL1、SL2、SL3和SL4)，其中SL2、SL3、SL4結(jié)構(gòu)域具有保守性基序，可形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。 5.利用DNA STAR軟件對DHV-I結(jié)構(gòu)蛋白的二級結(jié)構(gòu)和B淋巴細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果表明，VP0、VP1、VP3蛋白具有較復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，在VP1的第183-186區(qū)段、209-219區(qū)段，VP3的氨基端和第176-190區(qū)段可能含有病毒的優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位