亞硝酸細菌的快速檢測及熒光定量PCR檢測試劑盒的創(chuàng)建.pdf

1、分類號分類號密級UDC編號碩士學(xué)位論文亞硝酸細菌的快速檢測及熒光定量PCR檢測試劑盒的創(chuàng)建秦美川（20132116）指導(dǎo)教師姓名趙文教授專業(yè)名稱水生生物學(xué)論文答辯日期2016年5月27日學(xué)位授予日期2016年6月大連海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要亞硝酸細菌(Nitritebacteria），是在硝化細菌中，能在好氧條件下把氨氧化成亞硝酸的土壤細菌或海洋細菌，是硝化作用第一階段的作用菌。亞硝酸細菌廣泛存在于各養(yǎng)殖水域，能夠通過改變水環(huán)境中氨氮、

2、亞硝酸鹽濃度，改變水體環(huán)境條件，進而影響?zhàn)B殖生產(chǎn)。相比較物理、化學(xué)等方法降低養(yǎng)殖水環(huán)境中氨氮、亞硝酸鹽含量，微生物方法以其綠色安全、無公害、無毒副作用、無污染和藥物殘留等特點受到越來越高的關(guān)注和應(yīng)用。氨氧化細菌的氨單加氧酶(AmmoniaMonooxygenaseAMO)催化氨，氧化生成羥胺是硝化反應(yīng)的第一步，也是最為重要的步驟。amoA基因（AmmoniaMonooxygenaseA）是氨氧化細菌基因中編碼氨單加氧酶(AMO)活性位點

3、A的基因，由于不同屬的氨氧化細菌的amoA基因大不相同，相同屬內(nèi)的不同種的amoA基因也存在有DNA水平上的明顯差異，因此可以將amoA基因作為有效的特異性分子標(biāo)記對待檢測樣品中的氨氧化細菌進行種屬鑒定。故在本實驗中將amoA基因作為特異性檢測亞硝酸菌的目的基因。本文以?？曝愄厥暇–obetiamarinaDSM4741（T）鹽單胞菌屬鹽單胞菌科）的amoA基因為例設(shè)計了熒光定量PCR（QuantitativeRealtimePCR）

4、特異性引物，建立了?？曝愄厥暇鸁晒舛縋CR檢測體系，并在此體系上組裝了?？曝愄厥暇鸁晒舛縋CR檢測試劑盒，旨在為從分子水平上建立特異、敏感、快速的亞硝酸細菌檢測機制。進而使亞硝酸細菌的快速檢測能夠與亞硝酸細菌在其他領(lǐng)域的研究和實際生產(chǎn)應(yīng)用有效的結(jié)合在一起。實驗結(jié)果如下：第一，?？曝愄厥暇鷄moA基因片段全長的PCR擴增。用DNAPurificationKit試劑盒成功提取出海科貝特氏菌總DNA，根據(jù)海科貝特氏菌的amoA基因(KGA

5、02156)序列，通過Primerprimer5.0軟件分析設(shè)計了特異性amoA基因全長引物:CmAMOF:5CTGCTGACCTCGCTGGC3CmAM:5CTATTGCGTCGCCTCACG3采用引物CmAMOFCmAM直接擴增?？曝愄厥暇侱NA中的amoA基因片段，總長為1017bp。用EG101試劑盒回收純化所得到的amoA基因DNA片段，使用PEASYT3試劑盒將純化的amoA基因DNA片段與T3載體連接，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入Tr