MGB熒光定量PCR鑒別檢測(cè)豬瘟病毒及其動(dòng)態(tài)分布規(guī)律研究.pdf

1、豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)，是由豬瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起豬的高度致死性、接觸性傳染病。本研究建立了CSFV野毒株與豬瘟兔化弱毒疫苗株(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)的鑒別檢測(cè)方法，并完成了試劑盒的初步組裝。同時(shí)以豬的看家基因β—actin(ACTB)作為內(nèi)參，建立了CSFV核酸的相對(duì)定量PCR方法，并采用

2、該方法分析了CSFV石門(mén)株(SM)急性感染后的復(fù)制規(guī)律、動(dòng)態(tài)分布規(guī)律和組織嗜件規(guī)律。 為了從定量的角度探討CSFV急性感染后病毒的復(fù)制規(guī)律、動(dòng)態(tài)分布規(guī)律和組織嗜性規(guī)律，同時(shí)為CSFV鑒別檢測(cè)提供可靠的技術(shù)支持。本研究將熒光定量PCR(FQ—PCR)技術(shù)和ABI7500定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，對(duì)GenBank公布的CSFV全序列、牛病毒性腹瀉病病毒(BVDV)全序列和綿羊邊界病病毒(BDV)全序列進(jìn)行綜合比對(duì)，設(shè)計(jì)了一套針對(duì)CSFV野

3、毒株的特異TaqMan—MGB熒光探針和引物；同時(shí)，針對(duì)豬看家基因ACTB序列，設(shè)計(jì)了另一套特異性引物和探針作為內(nèi)參。經(jīng)過(guò)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了一套相對(duì)定量CSFV核酸的FQ—PCR方法，CSFV和ACTB RNA擴(kuò)增效率分別為91.7％和92.4％，CT值與模板起始濃度對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.998。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該方法對(duì)BVDV、PRRSV、FMDV等9種豬相關(guān)病原核酸擴(kuò)增陰性，顯示良好的特異性，同時(shí)對(duì)5廠家6批

4、次HCLV疫苗核酸擴(kuò)增為陰性，避免了HCLV對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，因此，該方法能鑒別檢測(cè)CSFV野毒株和HCLV株；該方法靈敏度比本實(shí)驗(yàn)室建立的RT—nPCR[1]．高1個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)極限達(dá)5.3×10-2pg病毒核酸；30個(gè)質(zhì)控樣本在5個(gè)月內(nèi)的CT值變異系數(shù)為1.70～7.66％，均小于10％，說(shuō)明該CSFV TaqMan—MGB PCR方法具有很好的穩(wěn)定性；對(duì)122份臨床疑似CSF的樣本檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，該方法與RT—nPCR的符合率為94.3

5、％。同時(shí)我們用CSFV TaqMan—MGB PCR方法和豬瘟免疫熒光方法(HCFA)對(duì)北京某豬場(chǎng)800多份扁桃體樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)兩種方法具有較高的符合率。 采用4×103.84TCID50 SM血毒1ml，肌肉注射感染16頭60日齡長(zhǎng)白豬，同時(shí)設(shè)立1頭陰性對(duì)照。感染全程進(jìn)行體溫監(jiān)測(cè)和臨床癥狀計(jì)分[2]，感染后每天隨機(jī)剖殺2頭，采集體內(nèi)各主要淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟、腎臟、腸道、心肌、腦組織等共22種組織、器官，并采用2- C

6、T方法[3]．進(jìn)行CSFV RNA的FQ—PCR定量榆測(cè)，定量指標(biāo)為相對(duì)感染密度，即單位細(xì)胞內(nèi)感染病毒的核酸含量。定量檢測(cè)結(jié)果顯示：1．CSFV SM血毒感染24h后，感染豬22種組織、器官均能檢測(cè)出CSFV核酸；2．從感染后第1天到瀕死前第8天，22種組織、器官的CSFV感染密度均呈總體上升趨勢(shì)。與第1天比，回腸、肝臟和頜下淋巴結(jié)第8天的感染密度分別上升5.997、5.649和5.175個(gè)數(shù)量級(jí)，上升最快。上升最慢的為腎臟和肌肉，增幅

7、分別為1.432和0.797個(gè)數(shù)量級(jí)；3．CSFV在胰腺、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、回腸、頜下淋巴結(jié)、脾臟、空腸、皮膚、肺、肝臟、扁桃體、直腸、回盲瓣、腎臟、脊髓、食道、膀胱、胃、十二指腸、肌肉、腦組織和心肌中的相對(duì)感染密度分別為5.069、5.053、4.964、4.925、4.843、4.792、4.514、4.076、4.034、3.989、3.919、3.830、3.711、3.580、3.555、3.188、2.935、2.

8、883、2.768、2.641、2.590和2.185個(gè)數(shù)量級(jí)。陰性對(duì)照豬上述組織、器官均未檢出CSFV核酸。 體溫監(jiān)測(cè)和臨床癥狀計(jì)分結(jié)果顯示：SM血毒感染后，從第2天開(kāi)始，少數(shù)出現(xiàn)食欲下降、精神萎頓、體溫升高，其后體溫逐漸上升，此間臨床癥狀計(jì)分迅速增加，伴隨體溫升至41℃左右，稽留36-48h，其問(wèn)食欲下降至廢厥，精神萎靡、站立不穩(wěn)，此后體溫開(kāi)始回落；至頻死前第7-8天，臨床癥狀計(jì)分達(dá)最高值22-24，感染豬出現(xiàn)呼吸急促、消瘦

9、、倒地、抽搐；耳、鼻、四肢、腹部皮膚潮紅、瘀斑；至頻死期時(shí)體溫回落至39.5-40℃。整個(gè)病程的加重程度與病毒載量的增加里正相關(guān)。陰性對(duì)照豬體溫維持在39.5℃左右，無(wú)CSF臨床癥狀。 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，CSFV抗原信號(hào)在感染后24h即可在被檢22種組織、器官中檢測(cè)到，初期陽(yáng)性信號(hào)主要集中于毛細(xì)血管內(nèi)，其后逐漸彌散到毛細(xì)血管外，進(jìn)入外周組織細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，且信號(hào)呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)。陰性對(duì)照豬試驗(yàn)期間呈健康狀態(tài)，未見(jiàn)陽(yáng)性