穩(wěn)定表達豬CD163蛋白的HEK-293細胞系的建立和鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失,其免疫機理非常復雜,并能利用多種策略逃避機體的免疫應答,現階段還缺乏切實有效的防治手段。病毒受體是被病毒利用的宿主細胞表面分子復合物,它們能介導病毒順利進入胞內。研究病毒受體能夠更深層次的揭示病毒與宿主細胞的相互作用機制,從而為制定有效的病毒防制措施提供新的思路。
　　 豬肺泡巨噬細胞(PAM)是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PR

2、RSV)入侵豬體的靶細胞,已發(fā)現在PAM上存在三種主要的PRRSV細胞受體:硫酸乙酰肝素(HS)、唾液酸粘附素(Sn)、CD163分子。HS的作用是吸附PRRSV到細胞表面,Sn可以加強吸附作用并介導PRRSV內吞進入胞內,CD163則是隨PRRSV一同進入胞內介導病毒的脫衣殼和病毒基因組的釋放。近年研究發(fā)現,將CD163分子轉染進入PRRSV非允許細胞,該細胞穩(wěn)定表達CD163蛋白后就能夠成功感染增殖PRRSV,成為PRRSV允許細胞

3、。鑒于此,本研究從PAM細胞中克隆了豬CD163基因,構建真核表達質粒pCDNA3.1/V5-pCD163,將其轉染進入HEK-293細胞,用G418加壓篩選,構建穩(wěn)定表達CD163蛋白的HEK-293-pCD163細胞系。主要研究內容包括以下幾個方面:
　　 1.豬CD163基因的克隆、序列分析及真核表達質粒pCDNA3.1/V5-pCD163的構建
　　 根據GenBank上報道的豬CD163基因序列(EU01622

4、6.1)設計引物pCD163-F和pCD163-R,以提取的PAM細胞總RNA為模板,RT-PCR擴增得到豬CD163完整編碼區(qū)cDNA序列,并將其克隆至pGEM-T easy載體。測序結果顯示,克隆得到的序列全長3348bp,編碼1115個氨基酸,該序列與GenBank中的參考序列同源性高達99.7％,關鍵作用區(qū)域SRCR5結構域氨基酸序列同源性為100％。在證實序列正確后用BamHI和XhoI酶切連接到真核表達載體pCDNA3.1/

5、V5-His B上,構建真核表達質粒pCDNA3.1/V5-pCD163。
　　 2.穩(wěn)定表達豬CD163蛋白的HEK-293-pCD163細胞系的建立
　　 將獲得的表達豬CD163蛋白的真核表達質粒pCDNA3.1/V5-pCD163,轉染HEK-293細胞,用G418篩選獲得穩(wěn)定表達豬CD163蛋白的293細胞系。并采用RT-PCR、免疫熒光和Western Blot方法證實了豬CD163蛋白在所構建的細胞系中的穩(wěn)

6、定表達。
　　 3.穩(wěn)定表達豬CD163蛋白的HEK-293-pCD163細胞系感染PRRSV的鑒定
　　 用PRRSV WUH3毒株感染建立的HEK-293細胞系,可觀察到明顯的細胞病變,并主要表現為細胞聚集、圓縮、細胞間出現空洞,最后細胞脫落、裂解。RT-PCR擴增可獲得PRRSV的特異性基因、免疫熒光和Western Blot均可檢測到病毒蛋白的表達,而未轉染豬CD163的HEK-293陰性細胞檢測均為陰性,說明構

7、建的細胞系確實能感染PRRSV,并允許PRRSV在其內增殖。
　　 4.PRRSV感染HEK-293-pCD163細胞系和Marc-145細胞的增殖曲線測定和比較
　　 用相同劑量的PRRSV WUH3感染HEK-293-pCD163細胞系和Marc-145細胞系,于感染后不同時間收樣,測定 TCID50,并繪制增殖曲線。PRRSV WUH3株在兩種細胞中的增殖曲線非常相似,但病毒在HEK-293-pCD163中的增殖滴