抗丁香假單胞菌HrpA單鏈抗體的制備.pdf

1、丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）是一種革蘭氏染色陰性細菌，其可使40多種植物致病，引發(fā)植物的葉片、根莖等處疾病，丁香假單胞菌侵染植物主要通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type III Secretion System,T3SS)，Ⅲ型分泌系統(tǒng)編碼過敏反應(yīng)和致病性基因（Hypersensitive response and pathogenicity，hrp），hrp基因涉及到Ⅲ型分泌系統(tǒng)蛋白的分泌同時與Hrp菌毛的組裝相關(guān)，

2、hrpA基因編碼Hrp菌毛的HrpA結(jié)構(gòu)蛋白,通過影響HrpA結(jié)構(gòu)蛋白功能能阻止Hrp菌毛的組裝，降低或阻止丁香假單胞菌對植物體的侵害。
　　本研究首先構(gòu)建 pGEX-6p-1-hrpA載體，并誘導(dǎo)表達 GST-hrpA融合蛋白， GST-hrpA蛋白經(jīng)割膠后用于小鼠免疫，同時將實驗室已構(gòu)建的pET32a-hrpA載體誘導(dǎo)表達TRX-HrpA融合蛋白，割膠純化后測定蛋白濃度TRX-HrpA蛋白濃度為1.501 mg/mL。然后從免

3、疫后效價達到要求的小鼠脾臟中提取RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，以 cDNA為模板利用通用引物擴增重鏈可變區(qū)基因（VH）和輕鏈可變區(qū)基因（VL），通過交錯延伸PCR將VH、VL和Linker（(G4S)3）按比例混合組裝擴增單鏈抗體（scFv）基因，再單鏈抗體基因構(gòu)建到噬菌體載體pCANTAB-5E上，獲得庫容量約為1.95×107 pfu/mL的噬菌體抗體文庫。最后應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)通過五輪的富集淘選獲得兩個與HrpA蛋白特異性