丁香假單胞菌殺線蟲毒性因子PtxA的殺蟲活性與作用機(jī)制.pdf

1、植物寄生線蟲(Plant Parasitic Nematodes)是一種高度專化型的雜食性植物病原線蟲，主要寄生在植物根部，幾乎可以感染所有的作物并造成作物減產(chǎn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)可造成全世界每年1500多億美元的經(jīng)濟(jì)損失。在長(zhǎng)期的防控植物寄生線蟲的實(shí)踐中，人們逐漸認(rèn)識(shí)到生物防治有著其它防治措施難以比擬的優(yōu)勢(shì)，而生防細(xì)菌在防控植物寄生線蟲實(shí)踐中發(fā)揮著獨(dú)特作用，因此基于生防細(xì)菌的生物防治技術(shù)的研究開發(fā)受到世界各國(guó)普遍重視。丁香假單胞菌（Pseudom

2、onas syringae）MB03是本實(shí)驗(yàn)室從感病植物組織中分離到的一株病原細(xì)菌，前期工作已證實(shí)該菌對(duì)模式線蟲秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）和主要的作物蟲害線蟲南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）均呈現(xiàn)殺蟲活性。本研究通過序列比對(duì)確定了一種新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA，對(duì)該蛋白的殺蟲活性、抑制線蟲生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、產(chǎn)卵和取食偏好等的性能和在線蟲體內(nèi)的作用部位進(jìn)行了觀測(cè);對(duì)該蛋白的

3、作用結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析;然后對(duì)其在線蟲體內(nèi)的可能受體進(jìn)行了初步篩選。所獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　基于MB03菌株的基因組序列構(gòu)建了該菌毒性蛋白與毒性因子的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)顯示MB03中共有200多個(gè)潛在的具有直接或輔助殺蟲的酶類或毒性蛋白，主要種類包括有Rhs家族、幾丁質(zhì)酶類、膠原蛋白酶類及溶血素類蛋白等。通過VirulentPred網(wǎng)站進(jìn)行輔助序列分析從數(shù)據(jù)庫(kù)中確定一種新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA作為研究對(duì)象。將P

4、txA基因克隆到大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)載體pET-28a上，并表達(dá)和純化獲得PtxA純蛋白。純化PtxA蛋白對(duì)秀麗隱桿線蟲顯示具有較強(qiáng)的毒性，測(cè)得LC50值為65.955(41.032～125.246)μg/mL，線性回歸方程（相關(guān)系數(shù)）為Y1=-4.493+2.47X1;對(duì)南方根結(jié)線蟲的生測(cè)LC50為139.825(30.139～264.375)μg/mL，線性回歸方程（相關(guān)系數(shù)）為:y2=-6.259+2.

5、917X2，也呈現(xiàn)很強(qiáng)的毒性作用。對(duì)秀麗隱桿線蟲L1期蟲體生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)表明，PtxA蛋白具有很強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)作用，在315μg/mL作用濃度下，實(shí)驗(yàn)組線蟲體長(zhǎng)僅達(dá)到對(duì)照組線蟲的50％。此外，PtxA蛋白能夠抑制線蟲產(chǎn)卵數(shù)，相同濃度下實(shí)驗(yàn)組線蟲產(chǎn)卵數(shù)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，在252μg/mL作用濃度下，實(shí)驗(yàn)組線蟲平均產(chǎn)卵數(shù)僅為對(duì)照組的30％。取食偏好性實(shí)驗(yàn)表明相對(duì)重組菌來說線蟲更偏向于取食含有空載的大腸桿菌。通過用綠色熒光標(biāo)記秀麗隱桿線蟲基因工程缺陷

6、蟲株FT63腸道和用FT63作為試蟲，經(jīng)PtxA作用3d后，觀察到實(shí)驗(yàn)組線蟲竹節(jié)狀熒光結(jié)構(gòu)遭到部分破壞，而對(duì)照組則很完整，說明PtxA蛋白可對(duì)線蟲腸道造成物理傷害。利用pDS3.0系統(tǒng)將ptxA基因敲除，比較PG平板上△PtxA和野生菌株MB03對(duì)秀麗隱桿線蟲的毒性，結(jié)果展示了二者毒性有一定的差異，△PtxA菌株平板上線蟲死亡率要小于野生菌株MB03。
　　為驗(yàn)證PtxA蛋白兩個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域的功能，將各自編碼基因片段分別克隆到表達(dá)載

7、體上，構(gòu)建大腸桿菌重組菌MB772和MB773，經(jīng)表達(dá)后得到純化蛋白DUF和M10_C。利用秀麗隱桿線蟲做試蟲進(jìn)行液體殺蟲試驗(yàn)，結(jié)果顯示兩個(gè)截?cái)嗟墓δ芙Y(jié)構(gòu)域片段均對(duì)線蟲有一定的毒性，其中DUF蛋白的毒性強(qiáng)于M10_C，但是兩個(gè)截?cái)嘟Y(jié)構(gòu)域的蛋白毒性弱于全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)域的蛋白毒性，反映出PtxA蛋白的毒性要靠?jī)烧邊f(xié)作才能完全發(fā)揮。
　　將PtxA作為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)從秀麗隱桿線蟲體內(nèi)獲取了20多個(gè)疑似受體蛋白，從中選取了rps9