抗SSA-Ro 60kDa抗原表位特異性單克隆抗體的表達(dá)和致病機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 抗SSA/R060kDa抗體見于多種自身免疫病患者，生理狀態(tài)下與SSA/Ro52核蛋白及hYRNA共同構(gòu)成核糖核蛋白復(fù)合體SSA/Ro抗原。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者血清抗Ro抗體陽(yáng)性率高達(dá)50％，而干燥綜合征(SS)患者血清陽(yáng)性率在50％以上。最初人們使用雙擴(kuò)散法在抗核抗體(ANA)陰性的SLE患者血清中發(fā)現(xiàn)該抗體。此后在SS的患者血清中證實(shí)為SSA[3]?？筍SA/Ro60kDa抗體除了和某些臨床表現(xiàn)相關(guān)

2、[4]，還和HLA表型和T細(xì)胞受體基因有關(guān)。出現(xiàn)Ro沉淀線的血清都有抗60kDa的抗體存在，與SSA/Ro60kDa抗原結(jié)合的hYRNA有四種，結(jié)構(gòu)短并且富含尿嘧啶。在部分抗SSA/Ro60kDa抗體陽(yáng)性的血清中往往出現(xiàn)抗SSA/Ro52kDa抗體。SSA/Ro60kDa-hYRNA和SSA/Ro52kDa的關(guān)系尚有爭(zhēng)議。Scofield等研究SSA/R060kDa蛋白7個(gè)氨基酸殘基的寡肽，發(fā)現(xiàn)了20個(gè)明確的抗原表位，并且發(fā)現(xiàn)患者血清和

3、這些表位的結(jié)合情況有較大差異。使用合成的60-kDaRo表位多肽免疫BALB/c鼠，出現(xiàn)針對(duì)整個(gè)抗原顆粒的抗體，這和人類的SLE或SS相似。而且免疫后的小鼠唾液流率較對(duì)照組下降，唾液腺出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 本課題首先成功構(gòu)建了抗Ro抗體單鏈可變區(qū)(Single-chainFv，ScFv)噬菌體抗體庫(kù)，根據(jù)課題組初步臨床研究的結(jié)果，人工合成SSA/Ro60kDa抗原3個(gè)表位多肽(P1表位:482～493，P2表位:310～323

4、，P3表位:230～241)，用3個(gè)多肽從ScFv噬菌體抗體庫(kù)中篩選獲得3個(gè)ScFv單抗。通過這三個(gè)表位特異性抗體研究SLE動(dòng)物模型腎臟SSA/Ro60kDa抗原表位的表達(dá)，解釋SLE發(fā)病的相關(guān)機(jī)制。
　　 研究目的
　　 1、驗(yàn)證利用噬菌體展示技術(shù)表達(dá)抗SSA/Ro60kDa抗原表位特異性抗體。獲取3個(gè)抗SSA/R060kDa抗原的表位特異性抗體，使用鎳柱進(jìn)行純化。
　　 2、利用獲得的抗SSA/Ro60kDa

5、表位特異性抗體研究MRL/1pr和BALB/c鼠腎臟SSA/Ro60kDa不同表位的表達(dá)。
　　 方法
　　 1、對(duì)接收克隆進(jìn)行序列分析，提取質(zhì)粒，制作感受態(tài)細(xì)胞。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌ORIGAMI，利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。SDS-PAGE膠電泳分析表達(dá)是否成功。Western-blot檢測(cè)目的蛋白中是否帶有6×His標(biāo)簽，使用鎳柱進(jìn)行蛋白純化。
　　 2以小鼠SSA/R060k

6、Da抗原為底物，ELISA法檢測(cè)抗體活性。用Hep-2細(xì)胞為底物，間接免疫熒光等方法檢測(cè)抗體活性。
　　 3、對(duì)MRL/1pr和BALB/c兩種鼠模型，通過免疫組化法分析腎臟、脾臟、肝臟等SSA/Ro60kDa抗原不同表位表達(dá)的情況。利用專業(yè)圖像軟件分析SSA/Ro60kDa抗原表位和器官損傷之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果
　　 1、對(duì)接收克隆的插入基因進(jìn)行序列分析，提示插入基因序列與此前提供的測(cè)序結(jié)果完全符合，插入基

7、因未發(fā)生突變。pET32a(+)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入表達(dá)菌ORIGAMI。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，SDS-PAGE膠電泳發(fā)現(xiàn)相應(yīng)分子量的目的蛋白大量表達(dá)。Western-blot提示目的蛋白均帶有6×his標(biāo)簽。經(jīng)Ni柱純化蛋白，獲得相應(yīng)的單鏈抗體。
　　 2、以小鼠SSA/Ro60kDa抗原為底物，ELISA法檢測(cè)抗體活性，結(jié)果顯示三種單抗反應(yīng)均為陽(yáng)性。以Hep-2細(xì)胞為底物，間接免疫熒光法檢測(cè)抗體的在體活性，結(jié)果顯示，三種抗體均

8、和Hep-2細(xì)胞結(jié)合，胞漿及胞核均有熒光染色，符合抗SSA抗體間接免疫熒光法檢測(cè)的熒光特點(diǎn)。
　　 3、MRL/1pr小鼠模擬人自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡和繼發(fā)性干燥綜合征。HE染色提示20周齡MRL/1pr小鼠腎臟出現(xiàn)大量炎細(xì)胞聚集，類似狼瘡腎炎的病理改變。同周齡的BALB/c小鼠腎臟未出現(xiàn)病理改變。
　　 4、MRL/1pr組和BALB/c組腎小球、近端腎小管、遠(yuǎn)端腎小管、集合管胞漿及胞核均可見棕黃色顆粒。Imag

9、e-proplus軟件分析結(jié)果顯示，MRL/1pr組和BALB/c鼠P1、P2、P3陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度(IOD)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MRL/1pr組及BALB/c組內(nèi)P1、P2、P3的IOD值，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、統(tǒng)計(jì)細(xì)胞核陽(yáng)性率，MRL/1pr組P3細(xì)胞核陽(yáng)性率高于BALB/c組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 6、MRL/1pr組內(nèi)P1、P2、P3細(xì)胞核陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.74，p<

10、0.05)。MRL/1pr組內(nèi)兩兩比較發(fā)現(xiàn)P3表達(dá)高于P1、P2表位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。BALB/c組內(nèi)P、P2、P3細(xì)胞核陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7、MRL/lpr小鼠脾臟增大，肝臟、心臟等實(shí)質(zhì)性臟器未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。兩組小鼠脾臟P1、P2、P3表位表達(dá)均為陰性；兩組小鼠肝臟組織P1、P2、P3染色均為胞漿彌漫淡棕色，胞核無著色。
　　 結(jié)論
　　 1、利用噬菌體展示技術(shù)可以成功表達(dá)