有機(jī)磷高特異性和寬譜單克隆抗體的篩選與比較研究.pdf

1、抗體的制備是小分子免疫化學(xué)分析方法的關(guān)鍵步驟,也是開(kāi)展免疫化學(xué)研究的核心內(nèi)容。為充分發(fā)揮異源免疫分析(免疫半抗原與競(jìng)爭(zhēng)半抗原的結(jié)構(gòu)不同)的優(yōu)勢(shì),提高雜交瘤細(xì)胞的篩選效率,獲得更高特異性或?qū)捵V選擇性的單克隆抗體,本研究選取有機(jī)磷類農(nóng)藥為研究對(duì)象,將異源ELISA引入到雜交瘤細(xì)胞的篩選過(guò)程中,提出并建立了一套高特異性和寬譜單克隆抗體的篩選體系。
　　 研究采用20種競(jìng)爭(zhēng)原建立異源ELISA方法同時(shí)篩選雜交瘤細(xì)胞,獲得了10株單克隆抗

2、體,其中新制備得到的抗對(duì)硫磷高特異性單克隆抗體與傳統(tǒng)方法(同源ELISA方法,免疫半抗原與競(jìng)爭(zhēng)半抗原的結(jié)構(gòu)相同)制備的5H7抗體相比,基于前者所建立的ELISA方法具有更高的方法靈敏度.而交叉反應(yīng)率試驗(yàn)結(jié)果表明,新制備的抗體5D11與5F7具有寬譜選擇性,其中基于5F7抗體所建立的異源ELISA方法可以用來(lái)檢測(cè)對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷、倍硫磷和辛硫磷五種有機(jī)磷農(nóng)藥,IC50分別為7.06 ng/mL、32.34 ng/mL、164.

3、84 ng/mL、500.94 ng/mL和96.97ng/mL.根據(jù)不同抗原一抗體組合的ELISA方法表現(xiàn),研究確定了采用異源ELISA方法進(jìn)行抗體篩選時(shí)的包被半抗原設(shè)計(jì)原則,并設(shè)計(jì)對(duì)硝基苯甲酸為包被半抗原來(lái)驗(yàn)證前期所提出的抗體篩選制備體系和方法,獲得了一株寬譜特異性單克隆抗體2H6?；?H6建立的同源和異源ELISA方法可以用來(lái)檢測(cè)對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷和水胺硫磷,最佳抗原一抗體組合的IC50分別為20.32 ng/mL、2

4、1.44ng/mL、42.15 ng/mL和58.85 ng/mL.土壤樣品中四種農(nóng)藥的單一添加和混合添加回收率試驗(yàn)結(jié)果表明,2H6抗體不僅可以用于土壤樣品中四種有機(jī)磷的單-農(nóng)藥殘留檢測(cè),而且其還可以用于對(duì)硫磷+甲基對(duì)硫磷的混合定量測(cè)定。而對(duì)于四種農(nóng)藥同時(shí)存在時(shí),該方法可以用于農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)的陽(yáng)性判定,是儀器定量檢測(cè)前的一種快速有效的初篩方法。
　　 在獲得多種高特異性和寬譜單克隆抗體的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步采用分子模擬的方法對(duì)

5、高特異性和寬譜抗體間識(shí)別特性差異的內(nèi)在原因進(jìn)行了探討。研究采用Accelrys公司的Discovery Studio TM軟件系統(tǒng),通過(guò)同源建模法構(gòu)建了高特異性單抗5H7和兩種寬譜單抗5F7和5D11的可變區(qū)三維模型,進(jìn)一步采用LibDoek模塊模擬對(duì)接了有機(jī)磷農(nóng)藥與三株抗體之間的分子互作行為,確定了抗體與農(nóng)藥分子互作的關(guān)鍵氨基酸殘基。分子模擬的結(jié)果表明:三株抗體與農(nóng)藥間的相互作用主要包括疏水相互作用、范德華力、氫鍵和π-π作用;CDR