多種魚類血清Ig廣譜型單克隆抗體的篩選與分析.pdf

1、魚類品種繁多,親緣距離大,在魚類免疫球蛋白檢測(cè)方面尚無(wú)通用的試劑。為了制備出廣識(shí)別譜的魚類免疫球蛋白檢測(cè)試劑,采用20株針對(duì)鱖、大黃魚、石斑魚、鰻鱺等魚類血清免疫球蛋白的單克隆抗體,對(duì)大黃魚、青石斑魚、斜帶髭鯛、美國(guó)紅魚、褐菖觸、鱖、加州鱸等26種常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)魚類的血清免疫球蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的分析,試圖篩選出廣識(shí)別譜的單克隆抗體或單克隆抗體組合。
　　 一、魚類的血清采集及其血清總蛋白分析。通過(guò)尾靜脈竇采集了大黃魚、青石斑魚、斜帶髭鯛

2、、美國(guó)紅魚、褐菖觸、鱖、加州鱸等26種常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)魚類的血清；通過(guò)Bradford方法測(cè)定血清總蛋白濃度。結(jié)果表明:這26種魚類血清總蛋白濃度在9.00mg·ml-1～50 mg·ml-1之間,同種魚不同個(gè)體之間血清蛋白總濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差都在1.90以上,存在明顯差異；不同科目之間魚血清蛋白濃度之間也存在很大的差異。
　　 二、免疫球蛋白的提取及其純度與活性的分析。分別采用優(yōu)球蛋白法與飽和硫酸銨分步鹽析法純化各種供試魚類的血清免疫球蛋

3、白,分別應(yīng)用SDS-PAGE、ELISA、Western-blot等方法分析提取物的純度和活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)優(yōu)球蛋白法的提取效果顯然優(yōu)于飽和硫酸銨分步鹽析法；以歐洲鰻鱺血清免疫球蛋白的提取結(jié)果為例:優(yōu)球蛋白法純化的歐鰻血清免疫球蛋白僅出現(xiàn)清晰的重輕鏈兩個(gè)條帶,純度高于飽和硫酸銨提取的免疫球蛋白,ELISA和Western-blot結(jié)果也證實(shí)優(yōu)球蛋白法純化的免疫球蛋白活性高于飽和硫酸銨提純的免疫球蛋白。結(jié)果提示優(yōu)球蛋白法可以作為一種提取魚

4、類血清Ig的方法,且具有快速、簡(jiǎn)單、高效的特點(diǎn)。
　　 三、魚類血清Ig共同抗原表位分析。選用20株針對(duì)鱖、大黃魚、石斑魚、鰻鱺血清免疫球蛋白的單克隆抗體,與26種常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)魚類血清免疫球蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng),從中篩選出廣識(shí)別譜的單克隆抗體。ELISA分析結(jié)果顯示:20種鱖、大黃魚、石斑魚、鰻鱺等魚類血清免疫球蛋白的單克隆抗體對(duì)大黃魚、青石斑魚、斜帶髭鯛、美國(guó)紅魚、褐菖觸、鱖、加州鱸等26種經(jīng)濟(jì)魚類血清免疫球蛋白交叉反應(yīng)存在差異。構(gòu)建

5、了這些單克隆抗體與26種經(jīng)濟(jì)魚類血清免疫球蛋白反應(yīng)交叉譜。其中單抗2H5F4識(shí)別譜最廣,能夠識(shí)別大黃魚、鱖魚、加州鱸魚、卵形鯧鲹、尼羅羅非魚、花鱸、紅羅非、青石斑魚、斜帶髭鯛、美國(guó)紅魚、黑鯛、鯉魚、黑脊倒刺鲃、平胸魴、白鯽魚、大菱鲆、褐菖觸18種供試魚的血清免疫球蛋白；歐鰻I(yíng)g單克隆抗體7E2可以與歐洲鰻鱺、鱖魚、鯉魚、翹嘴紅鲌、平胸魴、白鯽魚、海鰻、斑點(diǎn)叉尾鲴、黃顙魚、革胡子鯰、鯰魚發(fā)生交叉反應(yīng),將單抗2H5F4與單抗7E2等比例混合

6、后能夠與所采集的除牙鲆外的25種魚類血清免疫球蛋白發(fā)生反應(yīng)。這兩種單抗可以作為制備魚類免疫球蛋白廣譜檢測(cè)試劑的優(yōu)良備選抗體。
　　 四、免疫球蛋白抗原位點(diǎn)及其反應(yīng)特性分析。利用篩選到的廣譜型單克隆抗體7F12F6、2H5F4對(duì)多種魚類血清Ig的共同抗原表位進(jìn)行了初步研究。其中單抗7F12F6可以識(shí)別同為鱸形目的鱖魚、加州鱸魚、花鱸、大黃魚、美國(guó)紅魚、黑鯛六種魚的輕鏈,表明這六種魚的血清Ig具有相同或相似的抗原表位。單抗2H5F4

7、識(shí)別魚類免疫球蛋白的重鏈,在變性還原條件下的蛋白印跡顯示該單抗僅與大黃魚、青石斑魚、斜帶髭鯛、美國(guó)紅魚、褐菖鮋等五種魚免疫球蛋白的重鏈發(fā)生反應(yīng),在非變性非還原條件還能識(shí)別鱖、加州鱸魚、卵形鯧鲹、尼羅羅非魚、花鱸、紅羅非魚、美國(guó)紅魚、黑鯛、大菱鲆、鯉魚、黑脊倒刺鲃、平胸魴、白鯽魚、褐菖觸等另外13種供試魚的免疫球蛋白。上述研究結(jié)果提示:不同魚類免疫球蛋白之間存在共同抗原位點(diǎn),單抗2H5F4所識(shí)別的抗原位點(diǎn)在大黃魚、青石斑魚、斜帶髭鯛、美國(guó)

8、紅魚、褐菖觸等5種魚中表現(xiàn)為非結(jié)構(gòu)依賴性位點(diǎn),其反應(yīng)特性不受變性劑的影響,而在其余13種魚中則表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)依賴性位點(diǎn),且在變性條件下失去反應(yīng)活性。
　　 五、單克隆抗體反應(yīng)特異性驗(yàn)證。應(yīng)用單抗2H5F4測(cè)定免疫與非免疫尼羅羅非魚、鯉魚血清特異性抗體水平,免疫組與非免疫組尼羅羅非魚特異性抗體水平OD490為0.821、0.018；免疫組與非免疫組鯉魚特異性抗體水平OD490為0.282、0.070。試驗(yàn)結(jié)果表明免疫組檢測(cè)到了較高的抗