飼料中玉米赤霉烯酮的高效富集及免疫層析定量檢測(cè)方法的建立.pdf

1、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是由鐮刀菌所產(chǎn)生的具有類雌激素作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物。ZEN對(duì)食品和飼料的污染范圍較為廣泛，動(dòng)物和人體攝入后，對(duì)機(jī)體具有一定的毒害作用，對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)和人體健康會(huì)造成很大的損害。因此，加強(qiáng)對(duì)食品及飼料中ZEN的監(jiān)控檢測(cè)顯得尤為重要。由于飼料樣本存在一定的基質(zhì)干擾，對(duì)定量檢測(cè)的結(jié)果會(huì)造成一定的影響，本文采用了聚乙烯亞胺-戊二醛介導(dǎo)體系制備了ZEN免疫磁性微球，建立了高效富集捕獲飼料樣本中ZEN的方法

2、，以降低樣本的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。再以膠體金作為標(biāo)記材料，研制出了膠體金免疫層析試紙條，結(jié)合HG-8膠體金試紙條讀取儀，實(shí)現(xiàn)了對(duì)飼料中ZEN殘留的快速定量檢測(cè)。
　　通過(guò)DCC/NHS活潑酯法制備了ZEN-BSA人工全抗原，并通過(guò)TLC監(jiān)控和紫外全波段掃描驗(yàn)證ZEN-BSA成功合成，ZEN-BSA的濃度為2.55mg/mL；用辛酸-硫酸銨法純化了抗ZEN單抗，對(duì)抗體的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，測(cè)得效價(jià)為1:160000，濃度為5.36

3、mg/mL，通過(guò)SDS-PAGE電泳對(duì)純化后的單抗進(jìn)行了純度分析，結(jié)果表明該單抗具有較高的純度。
　　為了保證捕獲效率，本文以聚乙烯亞胺-戊二醛介導(dǎo)的方法制備了免疫磁性微球，對(duì)抗ZEN單克隆抗體的偶聯(lián)量進(jìn)行了優(yōu)化，最佳偶聯(lián)條件為：1mg磁球表面偶聯(lián)抗體100μg；對(duì)免疫磁富集捕獲緩沖液的pH、甲醇濃度、捕獲時(shí)間、微球加入量、洗脫液種類等條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳條件如下：將200μg PEI免疫磁球加入1mL20％甲醇PBS捕獲緩沖液（

4、pH7.0）中，在劇烈振蕩條件下提取10min，磁分離后用100μL3%氨化甲醇洗脫磁球上的ZEN，洗脫液稀釋復(fù)溶后用ELISA試劑盒檢測(cè)。通過(guò)樣本加標(biāo)回收試驗(yàn)的結(jié)果表明，當(dāng)ZEN加標(biāo)量為50-250μg/kg時(shí)回收率逐漸上升，且在250μg/kg時(shí)，回收率達(dá)到最高，為93.28%。
　　本文以膠體金作為標(biāo)記物，優(yōu)化了膠體金的粒徑、抗體標(biāo)記的pH值、抗體的標(biāo)記量、T線全抗原的包被濃度、C線二抗的包被濃度和金標(biāo)抗體的噴量等幾個(gè)參數(shù)，

5、確定了定量檢測(cè)ZEN膠體金免疫層析試紙條的最佳生產(chǎn)工藝條件：膠體金粒徑為40nm，標(biāo)記pH為6.0，抗體標(biāo)記量為4μg/mL，結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體噴量為2μL/cm，NC膜上T線ZEN-BSA的包被濃度為0.8mg/mL，C線上驢抗鼠二抗的包被濃度為0.4mg/mL。由此，成功地研制出ZEN膠體金免疫層析定量檢測(cè)試紙條，定量檢測(cè)時(shí)間為15min，該試紙條具有良好的特異性和穩(wěn)定性，最低靈敏度為2.559μg/L，IC50=9.09μg/L。