YKL-40誘導人支氣管上皮細胞發(fā)生EMT效應及誘導HMGB-1表達的研究.pdf

1、背景和目的:YKL-40是一種進化上高度保守的缺乏甲殼素酶活性的甲殼素酶蛋白家族成員之一，是新近發(fā)現的炎癥因子。近年來，多項研究證實YKL-40蛋白在炎癥、組織重塑的病理狀態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，以氣道重塑為主要病理學特征之一。目前證實YKL-40與支氣管哮喘發(fā)病過程中的氣道重構有密切關系。上皮-間質轉化是氣道重構的發(fā)生機制之一。有報道指出上皮-間質轉化的這一病理狀態(tài)能夠促進肺纖維化和哮喘氣道重構的發(fā)生

2、。那么，YKL-40能否誘導支氣管上皮細胞發(fā)生間質樣細胞改變，從而進一步促進氣道重構發(fā)生、發(fā)展，有待進一步的研究、探索。
　　HMGB-1是一種非組蛋白，屬于“損傷相關模式分子”(DAMP)家族的一員，細胞處于應激狀態(tài)時可觸發(fā)HMGB-1的主動或被動釋放。近年來，HMGB-1與支氣管哮喘發(fā)病的相關性得到越來越多的研究證實。
　　支氣管哮喘的發(fā)病具體機制尚不得而知。由于YKL-40和HMGB-1這兩種物質都是哮喘發(fā)病過程中的重

3、要調節(jié)因子，它們之間可能存在某種聯(lián)系，從而共同參與哮喘的發(fā)病過程。因此，本課題的主要研究目的是了解YKL-40蛋白在體外對支氣管上皮細胞（Beas-2B細胞）的影響，探討其能否誘導Beas-2B細胞發(fā)生上皮間質轉化(EMT效應)，同時明確其能否促進Beas-2B細胞表達和分泌HMGB-1。
　　方法:我們體外成功復蘇并培養(yǎng)了人支氣管上皮細胞(Beas-2B細胞)，以用來探討YKL-40誘導支氣管上皮細胞發(fā)生EMT效應和HMGB-1

4、的作用關系;用不同濃度的YKL-40蛋白刺激Beas-2B細胞24h后，在倒置顯微鏡下觀察Beas-2B細胞的形態(tài)學變化;同時采用細胞免疫熒光實驗檢測并比較細胞中上皮標志物E-cadherin和間質相關的標志物N-cadherin、Vimentin、α-SMA的熒光強弱變化;后進一步采用Western-Blot法檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Desmin的蛋白表達水平;另外，Beas-2B細胞接受不同

5、濃度的YKL-40蛋白刺激12h后，采用Real-time RT-PCR法測定細胞提取蛋白中的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Desmin的mRNA表達水平。后為進一步研究YKL-40對HMGB-1的影響，我們分別采用Elisa、real-time RT-PCR和Western-Blot法檢測不同濃度的YKL-40作用于Beas-2B后HMGB-1的表達情況。
　　按照實驗設計要求配制多種不同濃度的Y

6、KL-40蛋白溶液，并充分混勻，分別于六孔板每孔中加入一定體積濃度為1μg/mL的YKL-40蛋白使得各孔的終濃度分別為0ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL和400 ng/mL，混勻后放入細胞培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)24h。收集各孔培養(yǎng)液上清、細胞裂解液，并分別予以詳細注明、命名后待用。隨后采用Elisa方法檢測上清HMGB-1水平;采用Western Blot法檢測HMGB-1、E-cadherin、N-cadherin、Vim

7、entin和Desmin的蛋白表達水平;同時采用熒光實時定量PCR法檢測 HMGB-1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Desmin的mRNA表達水平;細胞免疫熒光染色法觀察細胞內E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和α-SMA的熒光強弱變化。同時在倒置顯微鏡下可以觀察各組不同濃度的YKL-40作用下支氣管上皮細胞(Beas-2B)的形態(tài)學變化。
　　結果:我們在顯微鏡下觀察到

8、，Bease-2B細胞受到不同濃度的YKL-40蛋白刺激后，其上皮細胞形態(tài)向間質細胞樣形態(tài)轉化，多數細胞由原來的上皮細胞“鋪路石樣”形態(tài)轉化為梭形、紡錘體形的間質細胞改變;同時，細胞免疫熒光染色結果表明，YKL-40能夠上調間質標志物N-cadherin、α-SMA、Vimentin的表達，而上皮標志物E-cadherin的表達則呈降低趨勢;隨后的RT-PCR和Western-Blot實驗也進一步證實了上述的結果，以上結果說明YKL-4