輻射誘導(dǎo)的外泌體miRNA介導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞旁效應(yīng)研究.pdf

1、電離輻射是能誘發(fā)生物效應(yīng)、對人類健康產(chǎn)生影響的天然和人為環(huán)境主要物理因素之一。另外，作為醫(yī)學(xué)診斷和放射治療的重要技術(shù)手段，輻射在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用在不斷擴(kuò)大。然而，無論是對接受放射治療的患者還是提供放射治療的醫(yī)師，正確認(rèn)識(shí)和有效的避免輻射帶來的損傷都是十分重要的。因此，研究減少輻射對正常組織產(chǎn)生的旁觀者效應(yīng)甚至遠(yuǎn)期損傷效應(yīng)都具有重要的意義，這也是放射生物學(xué)和放射治療學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的長期任務(wù)。
　　早在1992年，科學(xué)家已經(jīng)證實(shí)電離輻射

2、誘導(dǎo)的損傷不僅發(fā)生于直接受照的細(xì)胞，而且在其周圍的未受照細(xì)胞也發(fā)生一系列的損傷性改變，稱之為輻射旁效應(yīng)，輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)給周圍正常細(xì)胞和組織造成嚴(yán)重的危害。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，輻照細(xì)胞產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子和活性氧等小分子物質(zhì)參與輻射旁效應(yīng)，而輻射誘導(dǎo)miRNA的改變以及產(chǎn)生的旁效應(yīng)也陸續(xù)被報(bào)道，為了進(jìn)一步研究來自受照細(xì)胞的外泌體（exosome）miRNA在旁效應(yīng)中的作用，本研究以人正常支氣管上皮細(xì)胞BEP2D作為研究對象，利用輻照處理

3、細(xì)胞后，收集照射后的細(xì)胞培養(yǎng)基分離其中的外泌體，提取外泌體RNA并通過miRNA芯片技術(shù)分析外泌體中miRNA的表達(dá)譜變化，篩選出對輻射響應(yīng)較為明顯的miRNA并且進(jìn)一步驗(yàn)證，然后，對這些輻射誘導(dǎo)的外泌體miRNA在旁效應(yīng)中的作用及機(jī)制展開了深入研究。
　　目的：鑒定來源于輻照細(xì)胞的外泌體中miRNA表達(dá)譜，獲得輻射誘導(dǎo)表達(dá)的外泌體miRNA信息，研究其中部分miRNA（miR-7-5p和miR-1246）對人支氣管上皮細(xì)胞BEP

4、2D產(chǎn)生的旁效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：利用梯度超速離心法從培養(yǎng)液收集細(xì)胞分泌的外泌體；在透射電鏡下觀察并鑒定細(xì)胞分泌的外泌體形態(tài)；提取來源于照射和對照細(xì)胞外泌體中的RNA做miRNA芯片鑒定，選擇外泌體中受輻射影響較明顯的miR-7-5p和miR-1246作為研究對象，做進(jìn)一步的效應(yīng)研究；通過RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證miRNA分子的差異表達(dá)變化；通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性變化；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化；利

5、用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察外泌體在人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D中的攝入和miR-7-5p對細(xì)胞自噬泡產(chǎn)生的影響；通過western blot方法檢自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1、p62以及自噬相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)變化；通過免疫熒光原位雜交技術(shù)檢測BEP2D細(xì)胞中DNA損傷相關(guān)蛋白53BP1的foci形成、以及微核檢測實(shí)驗(yàn)來分析DNA損傷情況。
　　結(jié)果：（1）正常的人支氣管上皮細(xì)胞照射后的外泌體中miRNA的表達(dá)譜發(fā)生明

6、顯的變化，在照射后4hr外泌體中有6個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，6個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，照射后8hr外泌體中則有4個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，7個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，其中miR-7-5p和miR-1246在照射后4hr和8hr出現(xiàn)表達(dá)持續(xù)上調(diào)，而細(xì)胞內(nèi)的miR-7-5p以及miR-1246在照射后4hr的表達(dá)明顯降低（p<0.01）；（2）增加miR-7-5p表達(dá)明顯抑制細(xì)胞的增殖，細(xì)胞的自噬顯著（p<0.05），表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)自噬泡增多、自

7、噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1的表達(dá)明顯增加，p62的降解也增加。增加miR-7-5p表達(dá)對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期無明顯作用（p>0.05）；（3）細(xì)胞分泌的外泌體能夠被未照射的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D有效攝入，而且在未照射的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D中檢測到miR-7-5p的表達(dá)明顯增加（p<0.05）；（4）含miR-7-5p的外泌體處理未照射的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D后，也導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制和自噬增加，miR-7-5p抑制劑能夠

8、逆轉(zhuǎn)或減弱上述作用；（5)miR-7-5p誘導(dǎo)細(xì)胞自噬主要通過抑制靶基因EGFR的作用，對自噬相關(guān)信號(hào)通路中的AKT和mTOR的磷酸化也有明顯的抑制作用，miR-7-5p抑制劑處理后抑制作用消失，外泌體miR-7-5p有同樣的作用；（6）2Gy照射人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D后4hr收集的條件培養(yǎng)液能導(dǎo)致細(xì)胞的微核數(shù)目明顯增加（p<0.05），DNA損傷相關(guān)蛋白53BP1的聚焦點(diǎn)（foci）形成增多（p<0.05），即顯示出基因組DNA損

9、傷效應(yīng)；（7）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)增加外泌體miR-1246表達(dá)能誘導(dǎo)不同的未照射細(xì)胞產(chǎn)生微核（p<0.05），促進(jìn)DNA損傷相關(guān)蛋白53BP1聚焦點(diǎn)（foci）形成（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　本課題主要以正常的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D作為研究對象，鑒定了輻射誘導(dǎo)表達(dá)增加的外泌體miRNA分子，探討了其生物學(xué)效應(yīng)，研究結(jié)論總結(jié)如下：
　　1:輻射誘導(dǎo)正常的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D分泌外泌體到細(xì)胞外微環(huán)境中，照射后的外

10、泌體miRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯的改變；
　　2:照射后的外泌體中miR-7-5p和miR-1246在照后的一段時(shí)間內(nèi)都出現(xiàn)表達(dá)持續(xù)上調(diào)的現(xiàn)象，而此時(shí)的細(xì)胞內(nèi)則出現(xiàn)miRNA表達(dá)降低；
　　3:輻射誘導(dǎo)的外泌體miR-7-5p通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬而抑制細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制主要是通過對靶基因EGFR的調(diào)控下，影響了其下游的自噬相關(guān)通路AKT/mTOR，通過EGFR/AKT/mTOR軸調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬；
　　4:輻射誘導(dǎo)的外泌體m