外泌體——電離輻射誘導旁效應的另一種機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:首先驗證電離輻射是否在H460非小細胞肺癌細胞中誘導經培養(yǎng)液介導的旁效應;進而探索除細胞間隙連接和可溶性分子兩種信號介導方式外的新的旁效應信號介導機制。在文獻調研與預實驗基礎之上,探索外泌體是否為電離輻射誘導旁效應的一種介導機制。
  方法:采用條件培養(yǎng)液轉移的方法,以DNA損傷、微核形成和克隆形成為指標,檢測X射線在H460非小細胞肺癌細胞中誘導經培養(yǎng)液介導的旁效應。采用差速離心法從未輻照和輻照后的H460細胞培養(yǎng)液中提取

2、、純化外泌體,通過透射電子顯微鏡觀察其形態(tài),激光粒度儀分析粒徑分布,并用Western Blot檢測其標志蛋白hsp90β的表達。另外,檢測不同照射劑量以及照射后不同時間點細胞分泌外泌體的粒徑分布。通過熒光探針共定位實驗觀察外泌體進入接收細胞。采用結晶紫實驗檢測外泌體對接收細胞增殖的影響,同時檢測外泌體對接收細胞微核形成和克隆形成能力的影響。為探索外泌體中的RNA是否對引起接收細胞產生生物學變化發(fā)揮重要作用,預先將RNA酶與外泌體孵育以

3、滅活外泌體內RNA,去除殘留RNA酶后,將外泌體加入接收細胞中,觀察接收細胞微核形成率的變化。本研究采用Origin8軟件進行數據統(tǒng)計、分析和作圖,采用Student’s t-test進行統(tǒng)計學比較,當p值小于0.05時,認為兩比較組間的差異具備統(tǒng)計學意義。全部數據均來源于最少三次獨立重復實驗,用平均值±標準方差表示。
  結果:
  1.條件培養(yǎng)液介導電離輻射旁效應。相對于未受照射條件培養(yǎng)液(SCM)轉移組,將5Gy X射

4、線照射后1小時的H460細胞條件培養(yǎng)液(RCM)轉移到未做任何處理的旁效應細胞,旁效應細胞微核形成率增加了80%,克隆形成率降低了13%。相對于未受照射條件培養(yǎng)液(SCM)轉移組,將5Gy X射線照射后18小時的H460細胞條件培養(yǎng)液(RCM)轉移到未做任何處理的旁效應細胞,旁效應細胞微核形成率增加了3.5-5倍,克隆形成率降低了8.3%,DNA損傷增加了18%。并且,無論1小時還是18小時條件培養(yǎng)液轉移,5Gy X射線照射后的條件培養(yǎng)

5、液和10Gy X射線照射后的條件培養(yǎng)液產生的微核形成率沒有明顯差別。
  2.外泌體的分離和鑒定。采用差速離心法,可以簡便、快速地獲得外泌體。透射電鏡下可見典型的外泌體“盤杯狀”特征,大小在30-150nm。進一步通過Western Blot檢測普遍接受的外泌體標志物Hsp90β,確證提取物為外泌體。不管是否受到照射,H460細胞均分泌外泌體,但是在兩種情形下細胞分泌的外泌體的粒徑分布卻完全不同。并且,細胞分泌的外泌體尺寸依賴于細

6、胞受照劑量和照射后培養(yǎng)時間。
  3.外泌體與H460接收細胞的相互作用。將用熒光探針分別標記的外泌體與接收細胞共培養(yǎng)30分鐘后,觀察到從未受照射和受照射細胞培養(yǎng)液提取的外泌體均可迅速進入H460接收細胞中,可能是通過膜融合的方式。
  4.從條件培養(yǎng)液提取的外泌體可誘導接收細胞產生生物學效應。加入從未受照射細胞培養(yǎng)液提取純化的外泌體不改變接收細胞的微核形成率,然而,從受照射細胞培養(yǎng)液提取純化的外泌體使接收細胞的微核形成率增

7、加了兩倍。用RNA酶預先除去外泌體中RNA,再將此外泌體加入接收細胞,之前觀察到的細胞受照后條件培養(yǎng)液中提取的外泌體使接收細胞的微核形成率增加的生物學效應消失。另外,不管是否受照,與新鮮培養(yǎng)液對照組相比,H460細胞分泌的外泌體均能促進接收細胞增殖(增加11%左右)。但是,不管是否受照,與新鮮培養(yǎng)液對照組相比H460細胞分泌的外泌體均不影響接收細胞的克隆形成率。
  結論:
  1.X射線可在H460細胞中誘導經培養(yǎng)液介導的

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