受照角質細胞HaCat產(chǎn)生電離輻射旁效應信號機制的研究.pdf

1、目的：
　　電離輻射誘導的旁效應被定義為受照射細胞傳遞信號給周圍未受照射的細胞從而導致后者出現(xiàn)的生物學變化。盡管旁效應的概念已被廣泛接受，并且被認為可能在輻射致癌和放療的療效及副作用等方面發(fā)揮重要作用，但其發(fā)生的具體分子機制仍不明確。旁效應的產(chǎn)生需要兩個細胞群，即受照細胞和未受照旁效應細胞。本課題的主要目的是從受照細胞的角度出發(fā)，來研究旁效應發(fā)生的分子機制并在構建的體系中探究旁效應的后果。首先在HaCat角質細胞中觀察X射線是否能

2、在同種細胞內(nèi)誘導經(jīng)培養(yǎng)液介導的旁效應，并對其可能機制做初步研究，在此工作的基礎上，在以角質細胞HaCat和成纖維細胞WS1構建的二維培養(yǎng)模型中觀察X射線和α粒子能否誘導旁效應的產(chǎn)生，研究旁效應的發(fā)生是否與射線品質相關，并進一步研究其相關機制，然后，對旁效應產(chǎn)生的后果進行研究，以細胞遷移能力為指標觀察受照射角質細胞對未受照射角質細胞和成纖維細胞遷移能力的影響，最后，完成皮膚三維培養(yǎng)模型的初步構建，以期下一步在更接近機體正常環(huán)境的體系中研究

3、旁效應。
　　方法：
　　首先采用條件培養(yǎng)液轉移及二維共培養(yǎng)的方法，以微核（MN）、53BP1 foci、細胞增殖能力為生物學終點，檢測X射線在角質細胞HaCat同種細胞中誘導經(jīng)培養(yǎng)液介導的旁效應。用ELASA試劑盒檢測條件培養(yǎng)液中TGF-β1的含量，用ROS試劑盒檢測受到條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后的未受照射角質細胞內(nèi)ROS水平。
　　然后采用二維共培養(yǎng)的方法，以MN形成為指標，觀察角質細胞HaCat在分別經(jīng)X射線、α粒子照射后

4、能否在未受照射的成纖維細胞WS1中誘導旁效應的產(chǎn)生，探究該體系中旁效應的發(fā)生是否與射線品質有關。用TGF-β1受體激酶抑制劑SB431542抑制角質細胞HaCat內(nèi)TGF-β1信號通路后，觀察α粒子誘導的旁效應是否改變。用PCR檢測受照射HaCat細胞內(nèi)miR-21的水平，然后觀察經(jīng)轉染而過表達miR-21水平的細胞受α粒子照射后誘導的旁效應MN是否發(fā)生變化，觀察降低表達miR-21水平的細胞是否能在與之共培養(yǎng)的WS1細胞中誘導類似旁效

5、應MN的產(chǎn)生。用 Western Blot檢測經(jīng) X射線或α粒子照射后的角質細胞 HaCat內(nèi)TGF-β1/Smad2信號通路激活情況，觀察加入SB431542或者過表達該細胞miR-21水平后是否降低α粒子誘導的Smad2的磷酸化水平，觀察降低miR-21表達水平后該通路的激活情況。用PCR檢測經(jīng)SB431542預處理再經(jīng)α粒子照射后的HaCat細胞內(nèi)miR-21水平。觀察經(jīng)α粒子或X射線照射后的HaCat細胞內(nèi)ROS的含量。

6、　　采用同種細胞及異種細胞構建二維培養(yǎng)模型的方法，通過劃痕實驗觀察受α粒子照射后的HaCat細胞分別對未受照射角質細胞及成纖維細胞的細胞遷移能力的影響。
　　最后，以鼠尾膠原蛋白為基質，用角質細胞和成纖維細胞構建三維皮膚組織培養(yǎng)模型。
　　結果：
　　1、相對于相應對照組，經(jīng)3 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h及48 h后未受照射HaCat細胞MN形成率分別增加了28％和58%；經(jīng)該條件培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h后，未受照射HaCat細

7、胞53BP1 foci陽性細胞率增加了44%；經(jīng)該條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，未受照射HaCat細胞的細胞增殖能力無明顯變化。相對于新鮮培養(yǎng)液而言，3 h條件培養(yǎng)液中TGF-β1含量無明顯變化。相對于新鮮培養(yǎng)液組，經(jīng)3 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h后，未受照射HaCat細胞內(nèi)ROS水平增加了33%；但相對于相應對照組，經(jīng)3 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h后，未受照射HaCat細胞內(nèi)ROS水平無明顯變化。與受照細胞共培養(yǎng)48 h，未受

8、照射HaCat細胞微核形成率增加了54%；與受照細胞共培養(yǎng)1 h，未受照射HaCat細胞53BP1 foci陽性細胞率增加了35%。
　　2、I.在以角質細胞和成纖維細胞構建的二維培養(yǎng)模型中，以MN為指標，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)未受照射的WS1細胞在與受到α粒子（0.56 Gy）照射的HaCat細胞共培養(yǎng)24 h后MN形成率增加了53%，而X射線（1、2、5、10 Gy）均不能誘導該現(xiàn)象的發(fā)生。但這種現(xiàn)象并非因為X射線造成的損傷小，事

9、實上，2-10 Gy的X射線在HaCat細胞中造成的MN形成率和細胞致死率都高于0.56 Gy的α粒子。
　　II.在該模型中，在照前用SB431542預處理HaCat細胞使得α粒子誘導的旁效應微核降至本底水平。
　　III.α粒子（0.56 Gy）照射后HaCat細胞內(nèi)Smad2磷酸化水平立即增高，于1 h達到高峰，并一直持續(xù)至少兩個小時，而經(jīng)X（1 Gy）射線照射后0 h、0.5 h、1 h、2 h Smad2磷酸化水平

10、均無變化，加大X射線劑量至2、5、10 Gy同樣不會增加Smad2磷酸化水平。
　　IV.用10μM SB431542預處理HaCat細胞1 h，再用α粒子（0.56 Gy）照射，發(fā)現(xiàn)照射后1 h Smad2磷酸化水平在原有增加的基礎上明顯降低了。
　　V. PCR結果顯示信號細胞HaCat經(jīng)α粒子（0.56 Gy）照射后1 h，miR-21水平下降了1.6倍，3 h后miR-21水平下降了1.2倍；經(jīng)X射線（1 Gy）照射

11、后1 h，miR-21水平下降了1.4倍，3 h后卻升高了1.7倍。在此結果基礎上，過表達信號細胞中miR-21使得α粒子誘導的旁效應MN降至本底水平，而僅僅降低信號細胞中miR-21的表達就可以在與之共培養(yǎng)的WS1細胞中誘導類似旁效應的MN的產(chǎn)生。
　　VI.信號細胞HaCat用10μM SB431542預處理1 h，再經(jīng)0.56 Gyα粒子照射，照后1 h組miR-21的下降水平由原來的1.6倍變?yōu)?.2倍，而3 h組則由原來

12、的下降轉為升高。
　　VII.過表達HaCat信號細胞的miR-21水平，再用0.56 Gyα粒子照射后，與相應對照組相比其Smad2的磷酸化水平降低。而當先降低HaCat信號細胞的miR-21表達水平，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，即使不加照射，也會激活TGF-β1/Smad2信號通路。
　　VIII.α粒子（0.56 Gy）照射后5 h使得信號細胞內(nèi)ROS水平增加了25%，X射線（1 Gy）照射使得細胞內(nèi)ROS水平僅僅增加了3%。<

13、br>　　3、未受照射HaCat細胞在與受到α粒子（0.56 Gy）照射的HaCat細胞共培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后細胞遷移能力明顯增加，未受照射WS1細胞在與受到α粒子（0.56 Gy）照射的HaCat細胞共培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后胞遷移能力明顯減慢。
　　4、成功完成了三維皮膚組織模型的構建。
　　結論：
　　1、X射線可以在角質細胞同種細胞間誘導旁效應的產(chǎn)生。
　　2、在以角質細胞和成纖維

14、細胞構建的二維培養(yǎng)模型中發(fā)現(xiàn)α粒子照射后可以誘導旁效應的產(chǎn)生，而X射線不能誘導旁效應的產(chǎn)生，顯示旁效應的產(chǎn)生與射線品質相關。
　　3、在異種細胞二維培養(yǎng)模型中，α粒子誘導的旁效應與受照HaCat細胞中TGF-β1/Smad2信號通路的激活和miR-21的持續(xù)降低有關，并且TGF-β1/Smad2信號通路和miR-21之間存在互相調(diào)控的作用。
　　4、直接受照射角質細胞可以加快未受照射角質細胞的遷移速度，減慢未受受照射成纖維細