常山酮抑制電離輻射導致的腫瘤細胞上皮間質轉化(EMT)的機制研究.pdf

1、目的:研究常山酮對放療所致腫瘤細胞上皮間質轉化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)的抑制作用，并探討其可能機制。
　　 方法:采用MTT法觀察常山酮乳酸鹽對LLC細胞的毒性，確定合適給藥劑量。選用LLC細胞為研究對象，觀察常山酮對電離輻射所致的腫瘤細胞EMT的抑制作用。將LLC細胞分為4組，對照組不做任何處理;單純常山酮組予含恒定濃度常山酮乳酸鹽的全培養(yǎng)基培養(yǎng)并持續(xù)給藥至下一步實驗開始;單

2、純照射組予單次10Gy劑量的6-MVX線照射;聯(lián)合組先予常山酮全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，1天后予單次10Gy劑量的6-MVX線照射，細胞培養(yǎng)期間保持培養(yǎng)基內常山酮濃度恒定。采用免疫印跡法分別檢測照射后2天及5天時4組細胞的P-Smad3判斷TGF-β信號傳導通路激活情況，確定進一步實驗的時間點。通過顯微鏡觀察、劃痕實驗及Transwell侵襲實驗檢測4組細胞形態(tài)學、遷移及侵襲能力的變化。利用免疫印跡法檢測電離輻射及常山酮對LLC細胞EMT標志物

3、、TGF-β信號傳導通路下游相關蛋白（P-Smad2、P-Smad3和Smad7）的變化。
　　 結果:通過24、48h的MTT實驗繪制常山酮乳酸鹽對LLC細胞的抑制曲線并計算出48h時常山酮乳酸鹽對LLC細胞抑制20％時的濃度為31.17ng/ml。單純照射組LLC細胞表達的P-Smad3蛋白水平在照射后5天時較照射后2天時明顯升高，故進一步實驗的時間點選擇為照射后5天時。照射后5天時與空白對照組比較，單純常山酮組劃痕傷口愈合

4、面積減少，Transwell小室穿膜細胞數(shù)明顯減少，同時上皮標志物E-Cadherin表達升高，間質標志物N-Cadherin表達降低;與空白對照組比較，單純照射組細胞極性消失，并向紡錘樣間質細胞形態(tài)演變，劃痕傷口愈合面積明顯增多，Transwell小室穿膜細胞數(shù)增多，同時上皮標志物E-Cadherin表達降低，間質標志物N-Cadherin表達升高;聯(lián)合組較單純照射組間質細胞形態(tài)被逆轉，劃痕傷口愈合面積減少，Transwell小室穿膜

5、細胞數(shù)亦明顯減少，同時上皮標志物E-Cadherin表達升高，間質標志物N-Cadherin表達降低。TGF-β1信號傳導通路相關因子檢測發(fā)現(xiàn)，單純常山酮處理后的LLC細胞Smad2及Smad3蛋白的磷酸化水平較空白對照組明顯下降，Smad7蛋白表達較空白對照組明顯升高;10Gy單次照射后LLC細胞的Smad2及Smad3蛋白的磷酸化水平較空白對照組明顯升高，Smad7蛋白表達較空白對照組明顯降低;而聯(lián)合組LLC細胞的Smad2及Sma