γ電離輻射對(duì)破骨細(xì)胞代謝的效應(yīng)及機(jī)理研究.pdf

1、目的:研究γ電離輻射對(duì)破骨細(xì)胞代謝的效應(yīng)，并掌握相應(yīng)的輻照劑量，初步探究其效應(yīng)的機(jī)制。有利于進(jìn)一步了解電離輻射改變骨代謝的途徑，為防治電離輻射所致的骨損害提供新的思路。
　　 方法:本研究主要內(nèi)容包括四部分。第一部分研究2Gyγ射線全身單次輻照對(duì)小鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞代謝和骨吸收的影響。C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和輻照組。雙抗體夾心ELISA法測(cè)定輻照后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中骨代謝相關(guān)指標(biāo)TRAP-5b、sRANKL、CTX-

2、1和TNF-α;采用甲基百里香酚藍(lán)比色法測(cè)定血清中Ca2+濃度;TRAP染色骨病理切片觀察破骨細(xì)胞形態(tài)變化。第二部分建立體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)模型。通過(guò)使用小鼠重組sRANKL和轉(zhuǎn)移骨髓基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液兩種方法分別誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞株RAW264.7和骨髓單核細(xì)胞為破骨細(xì)胞。第三部分研究γ射線對(duì)RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響。在sRANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的過(guò)程中給予γ射線輻照，計(jì)數(shù)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量和檢測(cè)破骨

3、細(xì)胞代謝指標(biāo)TRAP-5b，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)輻照后細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2-含量;第四部分研究γ射線對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞代謝的影響。不同劑量的γ射線全身單次照射C57BL/6雄性小鼠后第1、2、3和7天，使用一步法RT-PCR檢測(cè)骨髓細(xì)胞中RANKL mRNA和OPG mRNA。給予體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞γ射線照射，ELISA法和共聚焦定量法檢測(cè)其RANKL蛋白的表達(dá)，并使用其條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞。
　　

4、 結(jié)果:各部分對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1)輻照后第4天，與對(duì)照組相比，輻照組小鼠血清中TRAP-5b、CTX-1、sRANKL和TNF-α含量分別升高了37.30％、47.14％、19.55％和17.67％(P＜0.05)，輻照組小鼠骨內(nèi)破骨細(xì)胞呈代謝活化相。輻照后第90天，輻照組小鼠血清TRAP-5b和CTX-1水平仍然要高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 (2)兩種方法均成功地誘導(dǎo)出由多個(gè)細(xì)

5、胞互相融合形成的TRAP陽(yáng)性多核破骨細(xì)胞。加入外源性的sRANKL刺激RAW264.7誘導(dǎo)出的破骨細(xì)胞比骨髓基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液刺激骨髓單核細(xì)胞形成的破骨細(xì)胞形態(tài)較大，數(shù)量也較多。
　　 (3)1、2、4Gy輻照組破骨細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);破骨細(xì)胞培養(yǎng)液中TRAP-5b的含量隨著輻照劑量的增加而升高，兩者呈正向直線線性相關(guān)（r2=0.919，P=0.041）。輻照后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平和Ca

6、2-水平均升高。
　　 (4)輻照小鼠后3天，2、4和6Gy組的骨髓細(xì)胞RANKL/OPG mRNA比值。
　　 與對(duì)照組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，RANKL/OPG mRNA比值的改變依賴RANKL mRNA的變化。γ射線輻照后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞的RANKL蛋白表達(dá)在輻照后早期增加。RANKL的表達(dá)升高具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，輻照劑量越大，RANKL升高得越早。輻照組骨髓基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)形

7、成的破骨細(xì)胞數(shù)量和TRAP-5b水平比對(duì)照組高，輻照劑量為2Gy時(shí)尤為明顯。
　　 結(jié)論:2Gy的γ射線全身單次輻照可促進(jìn)小鼠破骨細(xì)胞代謝，骨吸收增加，破骨細(xì)胞的代謝增強(qiáng)是電離輻照導(dǎo)致的骨損害的重要原因之一。γ射線促進(jìn)破骨細(xì)胞代謝活化的機(jī)制包括如下:
　　 1.γ射線通過(guò)升高破骨細(xì)胞活化的信號(hào)分子ROS和Ca2+，以劑量依賴的方式促進(jìn)破骨前體細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞。
　　 2.γ射線以劑量和時(shí)間依賴的方式早期促進(jìn)骨