人內(nèi)皮抑素重組腺病毒轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn).pdf

1、目的： 構(gòu)建人內(nèi)皮抑素重組腺病毒(Ad-ASP-hES)，并用其體外轉(zhuǎn)染正常人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(human retinal pigmental epithelium，HRPE)，探討轉(zhuǎn)染后HRPE細(xì)胞的人內(nèi)皮抑素(hES)表達(dá)情況，為內(nèi)皮抑素抗視。網(wǎng)膜新生血管生成的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．利用Adeasy 1系統(tǒng)，構(gòu)建Ad-ASP-hES。 2．體外培養(yǎng)正常HRPE細(xì)胞，角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒

2、定，觀察細(xì)胞形態(tài)。 3．Ad-ASP-hES體外轉(zhuǎn)染HRPE細(xì)胞，運(yùn)用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。 4。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)HRPE細(xì)胞中人內(nèi)皮抑素mRNA的表達(dá)。 5.免疫組化染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HRPE細(xì)胞hES的表達(dá)分布。 6．蛋白印跡法(Westernblot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液上清中hES的表達(dá)

3、。 結(jié)果： 1.重組腺病毒載體經(jīng)PCR鑒定正確，病毒滴度為lxl0<'8>PFU/ml，表明成功構(gòu)建了Ad-ASP-hES。 2．經(jīng)角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定可見(jiàn)細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色的陽(yáng)性反應(yīng)，表明體外培養(yǎng)的細(xì)胞為正常HRPE細(xì)胞。 3．體外轉(zhuǎn)染24h后，倒置熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞中綠色熒光蛋白(green nuorescent protein，GFP)熒光，間接反映目的基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率100％。

4、 4．RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，可見(jiàn)ASP-hES片段(623bp)的mRNA特異條帶，符合設(shè)計(jì)的片段大小。對(duì)照組無(wú)表達(dá)。 5．免疫組化可見(jiàn)Ad-ASP-hES轉(zhuǎn)染后，HRPE細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色的陽(yáng)性反應(yīng)，證實(shí)轉(zhuǎn)染后視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生人內(nèi)皮抑素。對(duì)照組中細(xì)胞胞漿無(wú)染色。 6．Western blot法檢測(cè)到Ad-ASP-hES轉(zhuǎn)染24h后的培養(yǎng)上清液中有人內(nèi)皮抑素蛋白表達(dá)，而對(duì)照組無(wú)表達(dá)。 結(jié)論