原位雜交法檢測視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞炎前因子mrna的表達(dá)

1、<p>　　原位雜交法檢測視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞炎前因子mRNA的表達(dá)</p><p>　　作者：宋宗明　惠延年　瞿佳　王雨生　馬吉獻(xiàn)　韓泉洪　杜紅俊 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 色素上皮細(xì)胞 </p><p>　　關(guān)鍵詞: 色素上皮細(xì)胞;視網(wǎng)膜;原位雜交;炎前因子;mRNA </p><p>　　摘 要:目的 觀察視網(wǎng)膜

2、色素上皮細(xì)胞（RPE）在炎性介質(zhì)刺激下炎前因子mRNA的表達(dá). 方法 培養(yǎng)的人RPE經(jīng)IL-1β（10μg&#12539;L-1 ）和脂多糖（1mg&#12539;L-1 ）的刺激后，用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交，檢測RPE炎前因子IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-αmRNA表達(dá).雜交結(jié)果使用圖像分析法進(jìn)行比較. 結(jié)果 原位雜交顯示RPE細(xì)胞質(zhì)中均呈現(xiàn)濃淡不一的淡藍(lán)色著色，胞核不著色.其中IL-6mR

3、NA在脂多糖刺激下染色較淺，增加脂多糖的劑量不能提高其表達(dá).圖像分析顯示在IL-1β（10μg&#12539;L-1 ）和脂多糖（1mg&#12539;L-1 ）刺激下，RPE表達(dá)IL-6mRNA的吸光度分別為108±18和35±14，二者之間有顯著性差異（P&lt;0.01）. 結(jié)論 在IL-1β和脂多糖刺激下，人RPE可以表達(dá)炎前因子IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α的mRNA.

4、 </p><p>　　Keywords:retinal pigment epithelium;retina;in situ hy-bridization;proinflammatory factors;mRNA </p><p>　　Abstract:AIM To determine whether retinal pigment epi-thelium（RPE）expresses pr

5、oinflammatory factors messenger RNA（mRNA）in cultured RPE cells stimulated by inflam-matory factors.METHODS Cultured RPE treated with IL-1β（10μg&#12539;L-1 ）and lipolysaccharide（1mg&#12539;L-1 ）was used as models.

6、The presence of mRNA coding for IL-1β，IL-6，IL-8and TNFαwas investigated by in situ hybridiza-tion（ISH）with biotin labeled oligonucleotide probes.Image analysis was performed to determine staining differences be</p>

7、<p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreo retinopathy，PVR）是常見的致盲性眼病之一，其發(fā)病的分子機(jī)制是目前眼底病研究的熱點(diǎn)［1-3］ .臨床研究發(fā)現(xiàn)許多炎前因子mRNA和蛋白質(zhì)在PVR膜中不同程度的表達(dá)，與PVR的發(fā)生明顯相關(guān)，其中IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α在玻璃體

8、切割液和PVR膜中水平較高［4-8］ .視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（reti-nal pigment epithelium，RPE）是PVR膜中的主要細(xì)胞成分，RPE細(xì)胞移行、增殖和分泌膠原在PVR形成中可能起重要的作用［1-8］ .我們用原位雜交法觀察培養(yǎng)RPE在炎性介質(zhì)作用下炎前因子IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-αmRNA的表達(dá)，以明確RPE是否表達(dá)炎前因子的mRNA，從而進(jìn)一步了解PVR發(fā)生的分子機(jī)制. </p>

9、<p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料 第3代RPE細(xì)胞由王雨生副教授惠增，培養(yǎng)條件為37℃，50mL&#12539;L-1 CO2 ，用含100mL&#12539;L-1 血清的DMEM培養(yǎng).對近融合期細(xì)胞以2.5g&#12539;L-1 胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代.選6～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑有:DMEM

10、培養(yǎng)基（Gibco產(chǎn)品）、胰蛋白酶（Sigma產(chǎn)品）和小牛血清（杭州四季青產(chǎn)品）.將18mm×18mm的蓋玻片分成4小塊，高溫高壓消毒后多聚賴氨酸包被.無菌玻片平鋪于直徑10cm的培養(yǎng)皿中，將200μL密度為4×104 mL </p><p>　　-1 RPE懸液滴于的蓋玻片中央，培養(yǎng)4h后補(bǔ)足培養(yǎng)液.細(xì)胞將近鋪滿時(shí)撈出玻片.終止培養(yǎng)前6h加入脂多糖（lipolysaccharride，LPS

11、）1mg&#12539;L-1 ，或者IL-1β10μg&#12539;L-1 .切片用PBS漂洗3次，40g&#12539;L-1 多聚甲醛固定1～2h干燥后-20℃保存. </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定 取細(xì)胞鋪片采用SABC法，進(jìn)行抗人角蛋白免疫組織化學(xué)染色.鼠抗人

12、細(xì)胞角蛋白單抗系Dako產(chǎn)品;SABC試劑盒為博士德生物工程公司產(chǎn)品. </p><p>　　1.2.2 雜交探針 生物素標(biāo)記IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α寡核苷酸探針產(chǎn)自上?；瞪锛夹g(shù)公司，探針序列分別為IL-1β:5’-TCA TCC TCA TTG CCA CTG TAA TAA GCC ATC-3’;IL-6:5’-CTC ACT ACT CTC AAA TCT GTT CTG GAG G

13、TA-3’;IL-8:5’-GTT GGC GCA GTG TGG TCC ACT CTC AAT CAC-3’;TNF-α:5’-GCT GGG CTC CGT GTC TCA AGG AAG TCT GGA-3’［8-10］ .3’Biotin標(biāo)記.原位雜交試劑盒由邁新公司提供. </p><p>　　1.2.3 原位雜交步驟 將細(xì)胞鋪片放置于經(jīng)潔凈處理的載玻片上，2～3滴新鮮稀釋的蛋白酶K，完全覆蓋玻片邊

14、緣以保證充分消化蛋白質(zhì)，37℃，10min.PBS漂洗3min×3次.37℃，5min孵育干燥.探針95℃，5min變性.置1滴探針于切片，蓋玻片封蓋.70℃，10min變性mRNA二級結(jié)構(gòu).濕房孵育37℃，3～4h使探針與目標(biāo)基因結(jié)合.37℃清洗液洗玻片直至蓋玻片脫落.滴1～2滴RNA酶A，37℃濕房孵育30min.蛋白阻滯劑37℃，3min×3次.加1～2滴鼠抗生物素，37℃濕房孵育40min.加1～2滴生物素化

15、羊抗鼠，37℃孵育20min.清洗劑漂洗5min.加1～2滴堿性磷酸酶-鏈霉蛋白結(jié)合物，濕房孵育20min.加1～2滴底物室溫孵育10min，直至完全顯色.通過顯微鏡觀察顏色的出現(xiàn)，陽性地方出現(xiàn)藍(lán)色.蒸餾水漂洗2～3次.過乙醇和二甲苯，樹膠封片. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:染色結(jié)果進(jìn)行圖像分析，方法是每組取4張切片，每張切片選15個(gè)細(xì)胞測定細(xì)胞質(zhì)中的吸光度，以x ±s表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較. </p><p><

16、;b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　培養(yǎng)的RPE細(xì)胞抗角蛋白染色表現(xiàn)為幾乎所有細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)濃淡不一的棕黃色著色.在IL-1β的刺激下，RPE細(xì)胞IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-αmRNA表達(dá)表現(xiàn)為胞質(zhì)中濃淡不一的紫藍(lán)色（Fig1，2），而未經(jīng)刺激的細(xì)胞則只有很少的細(xì)胞呈現(xiàn)淡藍(lán)色.在LPS的刺激下IL-6mRNA表達(dá)量稍低（Fig3，4），增加LPS劑量至20mg&

17、#12539;L-1 仍不能增加其染色強(qiáng)度. </p><p>　　圖像分析結(jié)果顯示在IL-1β和LPS刺激下IL-1β（97±15，101±23），IL-8（104±19，111±19）和TNF-αmRNA（90±21，100±26）染色的吸光度沒有明顯差異（P&gt;0.05）.IL-1β和LPS刺激后RPE表達(dá)IL-6mRNA的吸光度為10

18、8±18和35±14，二者之間有顯著性差異（P&lt;0.01）. </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　我們在研究中用原位雜交的方法對培養(yǎng)RPE進(jìn)行檢測，結(jié)果證實(shí)培養(yǎng)的人RPE在炎性介質(zhì)刺激下可以表達(dá)IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α的mRNA.以往對于PVR的多數(shù)研究主要是利用酶聯(lián)免疫吸附法和免疫

19、組織化學(xué)法檢測患者的PVR膜和玻璃體液［2-8］ ，多數(shù)是針對炎前因子的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究.也有少數(shù)用原位雜交的方法，但是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)無法表明其細(xì)胞來源.用ELISA和RT-PCR對于培養(yǎng)RPE的觀察表明RPE可以表達(dá)IL-1β等炎前因子［11-15］ ，但是這兩種方法有其缺點(diǎn)，ELISA法主要用于定量，對于無活性的物質(zhì)也無法區(qū)別，RT-PCR影響因素比較多，二者均不能進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)原位觀察. </p><p>　　我們用原

20、位雜交方法對培養(yǎng)的RPE觀察，既容易控制也可以進(jìn)行原位觀察，方法敏感.本研究觀察到在IL-1β或者LPS的刺激下，RPE可以表達(dá)炎前因子的mRNA，但是用LPS刺激細(xì)胞后IL-6mRNA的染色較淺，與IL-1β刺激后IL-6mRNA表達(dá)有顯著性差異，說明LPS不是IL-6mRNA的刺激因子.Elner等［11］ 和Benson等［12］ 用LPS刺激RPE細(xì)胞，沒有增加IL-6的mRNA表達(dá)，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)接近.PVR的本質(zhì)是機(jī)體對損傷的

21、過度修復(fù)反應(yīng)，是與炎癥和免疫有關(guān)的以時(shí)相為的特征的程序化過程，大致可以分為炎癥期、增生期和瘢痕期［1］ .炎癥期RPE細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可能在趨化細(xì)胞移動(dòng)、啟動(dòng)細(xì)胞增殖、分泌膠原和PVR形成的早期起重要的作用.在對大量玻璃體切割液的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)PVR眼玻璃體腔中IL-1，IL-6，IL-8和TNF-α等不同程度的升高.對于PVR眼視網(wǎng)膜前膜的觀察也有類似的發(fā)現(xiàn).據(jù)我們所知，PVR的確切機(jī)制還不清楚，玻璃體中這些細(xì)胞因子的來源也不清楚.我們

22、的研究結(jié)果顯示在IL-1或者LPS刺激后6h，RPE就會表達(dá)IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α的mRNA</p><p>　　圖1 －圖4 略 </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］Yannian H.Proliferative vitreoretinopathy:Topic brought i

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