豚鼠實(shí)驗(yàn)性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞HGF表達(dá)變化及鈣離子的研究.pdf

1、目的：建立豚鼠鏡片誘導(dǎo)型近視眼模型（Lens induced myopia，LIM），觀察豚鼠眼球前部及后極部視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞中肝細(xì)胞生長因子（HGF）的表達(dá)變化。研究HGF在近視中的作用，并采用激光掃描共聚焦顯微鏡（SLCM）對正常組和LIM組RPE細(xì)胞的鈣離子進(jìn)行測定，從離子水平進(jìn)一步探討近視的發(fā)病機(jī)理。
　　 方法：取2周齡豚鼠10只，隨機(jī)選取一只眼為實(shí)驗(yàn)眼（LIM組）對側(cè)眼為自身對照眼（Self-contro

2、l，SC組）。實(shí)驗(yàn)眼是采用離焦點(diǎn)的方法用-10.00D[1]凹透鏡誘導(dǎo)成近視眼模型，實(shí)驗(yàn)前后檢測每組豚鼠雙眼屈光狀態(tài)，用A超測雙眼眼軸長度。用細(xì)胞酶消化法原代培養(yǎng)豚鼠眼球前部及后極部RPE細(xì)胞，并傳1代。用免疫細(xì)胞化學(xué)法對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并對每組前部及后極部RPE細(xì)胞HGF的表達(dá)進(jìn)行定性半定量分析，用逆轉(zhuǎn)錄.多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測前部及后極部RPE細(xì)胞HGFmRNA的表達(dá)。對豚鼠RPE細(xì)胞進(jìn)行Fluo-3/AM負(fù)載，利用激

3、光掃描共聚焦顯微鏡測定LIM組及SC組RPE細(xì)胞鈣離子的變化。其結(jié)果用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1豚鼠實(shí)驗(yàn)性近視的誘導(dǎo)結(jié)果：豚鼠經(jīng)過45天的凹透鏡誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)組與自身對照組比較，誘導(dǎo)出-6.70±1.93D的相對近視，眼軸延長了1.53±0.31mm，前后變化差異有顯著意義（p<0.05）。
　　 2細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果：豚鼠RPE細(xì)胞培養(yǎng)后2-3天開始有細(xì)胞貼壁生長，1周左右匯合，

4、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定為RPE細(xì)胞。
　　 3免疫細(xì)胞化學(xué)研究結(jié)果：HGF在RPE細(xì)胞中的表達(dá)定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核無著色。LIM組前部和后極部表達(dá)多呈棕黃色，為+++；SC組前部和后極部表達(dá)多淺黃色，為+；LIM組和SC組各組自身前部及后極部比較，無顯著性差異（p>0.05）；LIM組RPE細(xì)胞前部和后極部的HGF的陽性表達(dá)率都明顯高于SC組的前部和后極部，且有顯著性差異（p<0.05）。
　　 4逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)（RT-

5、PCR）結(jié)果：LIM組與SC組RPE細(xì)胞HGFmRNA均有表達(dá)。LIM組與SC組各組自身前部及后極部HGFmRNA表達(dá)無顯著性差異（p>0.05）；LIM組前部和后極部HGFmRNA表達(dá)明顯高于SC組，且有顯著性差異（p<0.05）。
　　 5激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）檢測結(jié)果：LIM組與SC組RPE細(xì)胞均有鈣熒光。LIM組前部及后極部鈣離子的濃度明顯高于SC組，且有顯著性差異（p<0.05），而LIM組和SC組前部鈣離子

6、的濃度與后極部比較，差異無顯著意義（p>0.05）。
　　 結(jié)論：凹透鏡誘導(dǎo)可以引起明顯的軸性近視；體外培養(yǎng)的豚鼠RPE細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)HGF。LIM組RPE細(xì)胞中前部和后極部HGF及HGFmRNA的表達(dá)均明顯高于SC組。說明透鏡誘導(dǎo)豚鼠實(shí)驗(yàn)性近視眼RPE細(xì)胞中HGF無論在轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白表達(dá)上都增高，HGF在實(shí)驗(yàn)性近視眼RPE細(xì)胞中的活性升高，HGF通過間接方式參與實(shí)驗(yàn)性近視眼的形成。
　　 LIM組與SC組RPE細(xì)胞均